牛轮状病毒组RT-LAMP试剂盒

牛轮状病毒组RT-LAMP试剂盒储存条件及有效期：-20℃±5℃避光保存，有效期 12 个月。
产品运输：标本运送应采用 2-8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
质控标准：
阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

【结果分析条件设定】
u 基线（Baseline）设定：应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域（所有样本荧光信号无较大波动），起始点（Start）应避开荧光采集起始阶段的信号波动，终止点（End）应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1~3个循环，建议基线设为6~15。
u 阈值(Threshold)设定：将阈值线设定在刚好超过正常阴性质控品扩增曲线的点。
【质控标准】
1.   阴性质控品的检测结果应为阴性，无指数扩增期，Ct=40或无Ct；
2.   阳性质控品的检测结果应为阳性，有明显的指数扩增期，Ct值应小于等于35；
3.   以上要求需在一次实验中同时满足，否则该次实验视为无效。
【结果判断】
1.   阳性：有明显的指数扩增期，且Ct＜38； 2.可疑：有明显的指数扩增期，且38≤Ct<40，此时样本为可疑样本；对于可疑样本建议复核一次，若复核结果Ct<40且有指数扩增期，则判定为阳性，否则判定为阴性；
3.   阴性：无指数扩增期，Ct=40或无Ct值均判定为阴性样本。
【对检验结果的解释】
1.   实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；
2.   试剂运输、保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，可能会导致出现假阴性结果。

反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。