CUT&RUN

CUT & RUN（cleavage under targets and release using nuclease），即核酸酶靶向切割和释放技术，是一项用于在细胞天然染色质环境下检测蛋白-DNA复合体的新方法，与传统的ChIP-Seq研究方法相比，该技术无需甲醛进行交联剂免疫沉淀等操作，因此具有快速、所需低细胞量，背景信号低、重复性好等优点，可用于单细胞水平研究。CUT & RUN对于表观遗传、基因调控等领域的研究具有革命性意义。

 

技术原理

无需用甲醛进行交联剂免疫沉淀，通过针对靶蛋白（如转录因子、染色质重塑蛋白）特异性抗体和特异结合免疫球蛋白G（Protein A）的介导，使与Protein A融合的pAG-微球菌核酸酶（pAG-MNase）切割并释放靶蛋白结合的序列，获得目的DNA片段，并进一步建库测序。

技术应用

1. 挖掘蛋白质—DNA相互作用

2. 检测基因组上的组蛋白修饰，鉴定超级增强子

3. 检测基因组的开放性、转录因子结合图谱，鉴定超级增强子

4. 绘制核小体、RNAPII等蛋白的染色质图谱

 

技术特点

1. 样本量仅需50万个细胞

2. 数据信噪比高，背景低，数据重复性好

3. 操作简便，实验操作时间短，仅1天

 

分析内容

1. 基因组比对分析

2. 基因组富集分析

  2.1   富集区域基本信息

  2.2   富集区域分布特征

  2.3   Peak相关基因GO分析

  2.4   Peak相关基因KEGG分析 

  2.5   差异Peak相关基因GO，KEGG分析 

3. 富集区域motif分析

4. 超级增强子分析（H3K27ac抗体、BRD4抗体）

 

送样要求

样本类型：活细胞，5 x10⁵ 个细胞/样本

样本物种：仅限人、大小鼠，其他物种需评估。

 

表观生物实测数据

图1. TSS附近的reads分布图

*注释：reads分布在TSS附近

 

图2  TSS附近的heatmap图

*注释：由热图可见，TSS附近reads富集程度

 

图3  footprinting图

*注释：motif的footprinting可查看motif在各个位置上的切割频率，与峰调用相比，该方法可实现结合位置的更高分辨率映射。切割位点源自通过募集至抗体结合位点的pA-MN融合物染色质切割后产生的单个DNA片段的两端。由于染色质相关的蛋白结合，切割频率较低的区域倾向于受到保护，而没有结合的侧翼区域则显示较高的切割频率，特征性双峰，中心位置反映出motif位置范围

图4：log-odds图

*注释：由log-odds值对数量化了footprinting图中的切割位点，通过log-odds值得分对切割点进行排名，log-odds>5的得分位点可视为直接结合位点。

 

图5：IGV视图

图6：KEGG富集

 

 

参考案例

Cell：CUT & RUN技术的低细胞和高灵敏度的表观基因组学[1]

本研究方法检测多个转录因子（干细胞相关转录因子OCT4、SOX2和NANOG）、组蛋白修饰、鉴定超级增强子、染色质的开放性效果。CUT & RUN技术将蛋白质-DNA相互作用应用于低细胞量研究；甚至在单细胞研究中，仍然有较高的灵敏度。

1. 低细胞用量：

CUT & RUN技术分析CTCF 或H3K4me3测序结果：在这两种蛋白已知结合位点处的read可视化，显示10个细胞起始量的测序结果可以展现出类似50万个细胞量的结合位点富集热图。CTCF的结合区更为狭窄集中，而H3K4me3则占据相对宽的区段。而对照组（无抗体组）的热图则没有这种特征。

 

2. 鉴定超级增强子（super-enhancer）：

单细胞SOX2和NANOG CUT&RUN数据图中，在它们共同结合的Pou5f1 超级增强子区段内有多处富集。