中山病毒RT-LAMP试剂盒

中山病毒RT-LAMP试剂盒储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法 1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（*用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

FAM134B    FAM134B蛋白抗体
phospho-FANCA (Ser1149)    磷酸化范可尼贫血组蛋白A抗体
FANCC    范可尼综合征相关蛋白FANCC抗体
FXYD6    FXYD离子转运调节因子6抗体
FYB    Fyn结合蛋白抗体
FYCO1    锌指蛋白FYCO1抗体
FYTTD1    FYTTD1蛋白抗体
Fox2    RNA结合蛋白9抗体
FUT11    岩藻糖转移酶11抗体
中山病毒RT-LAMP试剂盒Fragilis    干扰素诱导蛋白15抗体
FAM48A    P38相互作用蛋白抗体
FLJ23834    钙粘样蛋白28抗体
FA20A    FA20A抗体
FGF18    成纤维细胞生长因子18抗体
FOXO1    叉头蛋白O1抗体
FGF6    纤维母细胞生长因子6抗体
FCAR    免疫球蛋白A Fc段受体1抗体
fatty acid elongase    脂肪酸延长酶抗体
FUT2    岩藻糖转移酶2抗体
fowl typhoid and pullorum disease    鸡白痢、鸡伤寒抗体
FANCF    范可尼贫血相关蛋白F抗体
Follistatin    卵泡抑素抗体
FASTK    Fas活化的丝/苏氨酸激酶抗体
FHIT    脆性组氨酸三联体抗体
Spastin    纤维母细胞表面蛋白抗体
FEM1A    前列腺素E受体4相关蛋白抗体
FLAG Tag (NT)    FLAG Tag标签抗体（N端）
FGFR2    成纤维细胞生长因子受体2抗体
FGFR4    成纤维细胞生长因子受体4抗体
FGL2    凝血酶原酶(纤维介素)抗体
Fibulin 5    衰老关键蛋白抗体
FLIP    凋亡调节基因之一抗体
FLIP    凋亡调节基因之一抗体（短型）
Fibronectin    纤维连接蛋白抗体
FOS B    FosB蛋白抗体
FRA2    FRA2/FOSL2抗体
FoxP3    叉头蛋白P3抗体
FGF8    成纤维细胞生长因子8抗体
Fascin    肌动蛋白结合蛋白Fascin抗体
FIS1    线粒体裂变1蛋白抗体
FoxP1    叉头蛋白P1抗体
F1 protein (YERSINIA PESTIS)    鼠疫F1蛋白/鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原F1单克隆抗体
FGF5    纤维母细胞生长因子5抗体
FMR1    脆性X综合征相关蛋白AFF1抗体
FAM84A    感觉神经蛋白1抗体
Frataxin    线粒体型共济失调蛋白抗体
Fc ε RIα    FC段IgE受体α多肽抗体
FAM81A    FAM81A蛋白抗体
FAM78B    FAM78B蛋白抗体
C9orf59    9号染色体开放阅读框59抗体
FAM76A    FAM76A蛋白抗体
FAM76B    FAM76B蛋白抗体
FAM92A1    FAM92A1蛋白抗体
FAM98A    FAM98A蛋白抗体
FRMD5    FRMD5蛋白抗体


具有如下优点：
　　(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
　　(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
　　(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
　　(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300 bp以内 gt;500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
　　二、LAMP（20μL 体系）
　　3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 阴性对照和阴性对照各 1 个。在 N+4 个 PCR 管中加入下列成分：
　　4. 混匀，此时反应液呈现非常浅的蓝色，由于是否有反应是跟阴性对照和反应前对比，所以一定要设置阴性对照，并且反应前要手机照相留存以供反应后比对。
　　5. 置于 25℃5min（让 UNG 灭活可能的 LAMP 的污染），然后放 61℃扩增60min。如果是在 PCR 仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴保温，没有热盖，必须在孔中加水以填充孔和管子间的空隙，并且在管中加 50μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率。
　　6. 80℃10min 灭活 Bst DNA 聚合酶和 UNG 酶。 　　7. 将反应管放置在白色背景前观察，观察反应液颜色并用手机照相留底。
　　8. 实验结果分析。阳性对照将呈现蓝色，无模板的阴性对照将呈现无色或非常浅的蓝色，样品管的颜色如果接近阳性对照则说明有扩增，如果接近阴性对照则说明无扩增。标准的反应结果如下图（9 号为阴性，10 号为阳性，此处的 9 号和 10 号跟下步的电泳照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）：如果需要也可以电泳确认实验结果：取 10μL LAMP 扩增产物直接进行 2%琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加 loading buffer），使用 100 bpDNA Marker。如果样品为阳性，将会得到梯形扩增产物。典型的电泳结果见下图（奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果。此处的 9 号和 10 号跟上步照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）。