犬瘟热病毒RT-LAMP试剂盒

犬瘟热病毒RT-LAMP试剂盒储存条件：
仅用于科研14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法 1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

ACTHR    促肾上腺皮质激素受体
AGRP    褐黑素相关蛋白ART抗体
Adrenodoxin    肾上腺皮质线粒体铁氧还蛋白抗体
Adracalin    Allgrove综合征相关蛋白抗体
AAV5 capsid protein VP1    腺相关病毒5 VP1抗体
ALDH3A2    脂肪醛脱氢酶抗体
AVPR1A    抗利尿激素1A抗体
AVPR1B    抗利尿激素受体1B抗体
ARFGEF2    二磷酸腺苷核糖基化因子鸟嘌呤核苷酸交换因子2抗体
ATBF1    α增强子结合蛋白1抗体
ATXN10    脊髓小脑共济失调10抗体
AKAP7    蛋白激酶A锚定蛋白7抗体
ABCA12    腺苷三磷酸结合盒转运体12抗体
ABCB9    腺苷三磷酸结合盒转运体9抗体
ABCD4    三磷酸腺苷结合盒转运蛋白4抗体
ABLIM3    肌动蛋白结合蛋白LIM3抗体
ACBD3    高尔基复合体相关蛋白1抗体
ACACA    乙酰辅酶A羧化酶1ACCα抗体
ANT1+ANT2+ANT3+ANT4    腺嘌呤核苷酸转运蛋白1、2、3、4抗体
ADAM12    去整合素样金属蛋白酶12
Phospho-Acetyl CoA Carboxylase(Ser79)    磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1ACCα抗体
AX2R    膜粘连蛋白2受体抗体
AGER    晚期糖基化终末产物特异性受体抗体
ADCK5    ADCK5蛋白抗体
AGFG1    艾滋病病毒复制结合蛋白抗体
AFP4b    AFP4b蛋白抗体
AGFG2    HIV-1病毒复制结合蛋白2抗体
CABC1    伴侣蛋白bc1同源复合体抗体
ANKRD1    心肌锚蛋白重复结构域1抗体
ARRDC1    抑制蛋白结构域蛋白1抗体
ARRDC2    抑制蛋白结构域蛋白2抗体
ARRDC3    抑制蛋白结构域蛋白3抗体
ARRDC4    抑制蛋白结构域蛋白4抗体
alpha Estradiol    雌二醇抗体
APLP2    淀粉样蛋白β前体样蛋白2抗体
APLP1    淀粉样蛋白β前体样蛋白1抗体
犬瘟热病毒RT-LAMP试剂盒APC70    转录激活蛋白crsp70抗体
ACTBL1    卵巢、胎盘、前列腺、睾丸蛋白22抗体
ANKRD33B    锚蛋白重复结构域蛋白33B抗体
APOC3    载脂蛋白C3抗体
Apoptosis enhancing nuclease    细胞凋亡增强核酸酶抗体
ATAD5    染色体脆弱性相关基因抗体
phospho-AKT (Ser473)    磷酸化蛋白激酶B抗体
ATP7B    铜转运蛋白质β链抗体
ACSF4    酰基辅酶A合成酶家族4抗体
ACPL2    酸性磷酸酶样蛋白2抗体
使用方法:
一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取 Cps DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 Cps 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DN**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（*用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 Cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

具有如下优点：
　　(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
　　(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
　　(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
　　(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300 bp以内 gt;500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。
　　二、LAMP（20μL 体系）
　　3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 阴性对照和阴性对照各 1 个。在 N+4 个 PCR 管中加入下列成分：
　　4. 混匀，此时反应液呈现非常浅的蓝色，由于是否有反应是跟阴性对照和反应前对比，所以一定要设置阴性对照，并且反应前要手机照相留存以供反应后比对。
　　5. 置于 25℃5min（让 UNG 灭活可能的 LAMP 的污染），然后放 61℃扩增60min。如果是在 PCR 仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴保温，没有热盖，必须在孔中加水以填充孔和管子间的空隙，并且在管中加 50μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率。
　　6. 80℃10min 灭活 Bst DNA 聚合酶和 UNG 酶。 　　7. 将反应管放置在白色背景前观察，观察反应液颜色并用手机照相留底。
　　8. 实验结果分析。阳性对照将呈现蓝色，无模板的阴性对照将呈现无色或非常浅的蓝色，样品管的颜色如果接近阳性对照则说明有扩增，如果接近阴性对照则说明无扩增。标准的反应结果如下图（9 号为阴性，10 号为阳性，此处的 9 号和 10 号跟下步的电泳照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）：如果需要也可以电泳确认实验结果：取 10μL LAMP 扩增产物直接进行 2%琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加 loading buffer），使用 100 bpDNA Marker。如果样品为阳性，将会得到梯形扩增产物。典型的电泳结果见下图（奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果。此处的 9 号和 10 号跟上步照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品）。