Lexogen SLAMseq-Metabolic RNA

标准的RNA-seq方法可以评估总RNA丰度，但不能解决RNA转录和降解整体动态水平的动力学问题。SLAMseq系列产品以时间作为RNA-Seq的一个新维度，能同时对新合成的和已有的RNA进行定量分析。
产品优势

• 可进行转录组--RNA合成及降解的动力学分析；
• 获取控制基因表达的新见解；
• 建立刺激诱导的RNA转录和降解之间序列改变的模型；
• 通过比较新生转录水平，显著提高差异表达的分辨率；
• 只需向RNA-Seq工作流添加两个步骤，无需pull-down实验或生化隔离；
• 对于时间分辨的RNA-seq，整合了Lexogen’s SLAMseq标记试剂盒，QuantSeq3’mRNA-Seq文库构建试剂盒，以及SLAMdunk分析软件。

工作流程

Figure 1 | SLAMseq工作流示意图。培养的细胞用4-硫代嘌呤(S4U)标记新生RNA(绿色)。抽提纯化Total RNA，并加入IAA诱导4-巯基烷基化。用QuantSeq 3’ mRNA-Seq文库构建试剂盒进行文库构建，在反转录过程中，S4U位点会反转录成鸟嘌呤 (G，红色)而不是腺嘌呤(A，黑色)。因此，在随后的数据分析过程中，可以通过T>C突变信息区分已有的RNA和新合成的RNA。
SLAMseq 试剂盒
从S4U标记条件的优化到进行S4U标记动力学实验，以及后续的RNA提取和烷基化，SLAMseq试剂盒为RNA代谢测序实验提供了一个完整的解决方案。(Tab. 1 和 Tab. 2).

产品应用
测定RNA合成及降解速率
用S4U标记小鼠胚胎干细胞，随后抽提出总RNA，烷基化，用QuantSeq 3’mRNA试剂盒进行文库构建和测序。首先，用S4U标记mESCs 24小时，然后用未标记的尿苷进行冲洗和尿苷终止反应(U终止反应)。测序数据用SLAMDUNK软件进行分析，测定整个转录组的RNA周转率。Fig.2显示了两个基因合成与降解的典型动力学实验数据。转录因子HES1具有高的周转速率（RNA合成与降解速率高），而对于管家基因NDUFA7，它的周转速率较低。

Figure 2 | S4U标记动力学实验揭示个体RNA合成与降解的速率。测定RNA的合成速率，用S4U(100 μM)处理 24小时；测定RNA的降解速率，用S4U饱和处理细胞，然后去除S4U并且添加未标记的尿苷(U Stop)进行测定。
新转录RNA及总RNA差异表达谱并行分析
SLAMseq可以在同一个样本中同时分析总RNA及新转录RNA的表达情况。为阐明常规、稳态RNA测序和SLAMseq代谢RNA测序之间的差异，Muhar等人在人细胞系中做了基因差异表达分析(Muhar et al., 2018)。SLAMseq可显著提高基因差异表达检测和定量的灵敏度(Fig. 3A)。SLAMseq可分析新合成mRNA水平来揭示抑制剂处理对转录的反应，而常规RNA-Seq却不行(Fig.3B)。因此，SLAMseq是揭示细胞反应潜在机制和药物发现研究的理想选择。

Figure 3 | SLAMseq提高基因差异表达灵敏度检测。A) BCR / ABL抑制剂处理组（尼洛替尼）与DMSO对照组相比，K562细胞新合成RNA（T>C转换reads，绿色显示）水平显示出比总mRNA（灰色）更高的变化倍数。B）新合成mRNA（绿色）与总mRNA水平（灰色）对比分析，前者检测到更多的差异表达基因。图片来源于 Muhar et al, 2018.
SLAM-ITseq: 确定哺乳动物体内特定组织和细胞类型的基因表达
对于该应用，将4-硫尿嘧啶(4-Thiouracil,不是LAMseq中的S4U)注射到转基因生物体中，例如仅在特定细胞类型中表达尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）的小鼠中，新合成RNA仅在该细胞类型中被标记，然后提取纯化RNA，最后进行标准的SLAMseq分析。可根据RNA -seq数据中碱基的转换信息，对体内特定组织和细胞类型的基因表达进行定量（Matsushima et al.,2018）。 SLAMseq合成代谢动力学试剂盒模块包含SLAM-ITseq所需的组分(4-Thiouracil除外)，同时SLAMdunk软件与SLAM -ITseq数据兼容，可对其进行分析。
SLAM-ITseq:监 测体内RNA的运输
组织特异性表达的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT）和基于4-Thiouracil标记的RNA也可用于监测组织间RNA的运输 (Sharma et al., 2018).
SLAMdunk – SLAMseq数据分析软件
Lexogen可以为客户提供对SLAMdunk1的访问，可定制化分析来自QuantSeq 3'mRNA-Seq文库的SLAMseq RNA-Seq数据。用户在Bluebee®Genomics平台上使用SLAMdunk软件可以很容易的对SLAMseq实验数据进行分析。只需上传压缩的fastq文件并选择适当的物种即可。处理数据之后，SLAMdunk可获得T> C转换率统计数据，以及比对到3'UTR区域的统计数据，然后可以从Bluebee®平台下载结果。 SLAMseq，QuantSeq和SLAMdunk为高通量时间分辨RNA-Seq实验提供了完整且友好的解决方案。
References
1. Herzog, V., et al. (2017) Nature Methods, DOI: 10.1038/nmeth.4435
2. Muhar, M., et al. (2018) Science, DOI: 10.1126/science.aao2793.
3. Sharma, U., et al. (2018) Developmental Cell, DOI: 10.1016/j.devcel.2018.06.023
4. Matsushima, W., et al. (2018) Development, DOI: 10.1242/dev.164640
5. Lexogen GmbH (2017) SLAMseq Explorer and Kinetics Kits – User Guide, Pub. No 059UG142V0103.