StarLighter 文库定量试剂盒（Illumina）

StarLighter Library Quantification Kit (Illumina®）

StarLighter文库定量试剂盒(Illumina®）

1产品描述
文库精确定量对于二代测序的结果是非常重要的。过低估计文库浓度，会导致簇生成过多，数据质量差;过高估计文库浓度，则导致数据产出量少，基因组覆盖率低。所以低估或者高估文库浓度都会影响测序效果。qPCR是DNA文库定量的标准，也是唯一种能够准确检测出分子数目的方法。

StarLighter Library Quantification Kit(Illumina )试剂盒提供基于染料法qPCR的Illummina@文库定量所必须的试剂。试剂盒包括:

Starighter Library Quantification Standards1-6(10倍线性梯度稀释，模板长度452 bp)

10x StarLighter Primmer Mix，具体包含下面两条引物:

引物1:5'-AAT GATACGG

引物2:5CAAGCAGAAGACGGC ATAGA-3'

2x StarLighter SYBR Green qPCR Mix(适用于文库定量)

文库定量是利用qPCR定量试剂、定量引物，通过qPCR方法操作6个10倍稀释的DNA标准品和稀释后的文库样品，根据6个确定浓度的DNA标准品生成标准曲线，然后用绝对定量法通过标准曲线计算得到稀释后的文库样本浓度。

该文库定量试剂盒已经过严格测试，以确保最小的误差。该试剂盒包含了新型耐受SYBR Green 染料的快速DNA合成酶。该工程聚有较高的扩增效率，且能够均衡扩增不同的DNA片段可对平均长度长达1kb的Illumina,文库进行可靠的定量分析，并且对文库类型和GC含量没有限制。

2 产品应用
StarLighter Library Quantification Kit (Illumina)文库定量试剂盒是专为Illumina测序前的文库准备设计的精确和可重复的定量试剂盒。本试剂盒适用于任何浓度>0.0002pM，并且包含和引物互补序列的文库，而文库的类型、文库构建方式，或者何种Illumina测序仪器都无需考虑。该试剂盒支持不同GC含量和平均片段长度高达1 kb的文库量化。除了NGS文库定量，该试剂盒也可用于检测Illumina 文库的制备过程中工作空间的文库污染。该文库定量测定包含重复移液的步骤，可以进行自动操作。

3 产品的兼容性
StarLighter Library Quantification Kit (Illumina )文库定量试剂盒适用于任何包含P5、P7序列的NGS文库的量化(准备进行Illumina测序)。用部分或茎环Adapter制备的文库只能在扩增后使用此试剂盒进行定量。需确保文库准备过程中使用的Adapter序列和产品描述中的文库定量所用引物序列兼容。按照qPCR仪器对参考染料Rox的要求，选择使用合适的Rox。

4产品规格
4.1运输和储存
该文库定量试剂盒可根据目的地国家、地区使用干冰或冰袋运输。接收后，立即将整个试剂盒存放在-15℃℃至-20℃℃恒温冰箱。正确储存条件下，试剂盒所有成分能够在标签显示效期内保持全部性能。

4.2 处理
确保所有成分在使用之前都解冻并漩涡震荡混匀。SYBR Green染料(包含在定量试剂中)Rox染料都对光敏感，长时间暴露在直射光下会导致荧光信号强度下降。

该文库定量试剂盒的所有组分，可以稳定通过30次循环冻融。确保所有试剂在不使用的情况下是-20℃℃避光储存。当避光储存时，试剂可以在2℃-8℃℃稳定存贮至少一周，短期使用可存储在该温度下，但要确保不被微生物或者核酸酶污染。

4.3 质量控制
试剂盒所有组件都经过严格的功能性质量控制，不存在可检测的杂质和核酸内切酶活性并对DNA污染有严格要求。

5 重要参数
该试剂盒为准备Illumina 测序的文库提供准确和可重复的定量结果。

5.1样品浓度和稀释
待定量文库要稀释到检测的动态范围，即20pM-0.0002pM或5.5pg/μl-0.000055 pg/μl或12x10“-12x10'个dSDNA分子/ul。任何浓度大于标准品 1的文库，不应使用该试剂盒做文库浓度计算，必须对其进行适当稀释，如果稀释后浓度属于检测的动态范围，则可以用来文库定量。所以，当待测文库的浓度较高时，为保证最佳定量结果，最好将文库稀释到标准品 1至标准品3之间。
文库稀释倍数应根据同类型库的经验进行估计或换算，或采用其他类似的工作流程，或参考其他方法获得的文库建设过程中的质量控制信息(例如使用Qubit或 Bioanalyzer、Nanodrop)
当测试多个文库时，若某些文库浓度(如Qubit浓度)差异不大，为减少计算量或为操作简便，可采用相同的稀释倍数。

5.2 样品质量
由于稀释的DNA会在无缓冲环境下降解，待测文库或实验对照品必须用缓冲溶液存储和稀释，如10mM Tris-HC1，pH值8(25°C)，可在稀释缓冲液中添加0.05%的Tween~20来提高移液的准确性和减少DNA吸附。不要用水直接稀释待测文库或实验对照品。
每次检测时要准备现稀释的样品，并在进行qPCR操作时保持在冰上。样品在室温下存放或者放置长时间(如超过3小时，即使在4℃)会导致后面计算文库的浓度值不准确，则必须重新测定，并重新准备稀释样品。

5.3准确的液体处理
由于qPCR是非常灵敏的技术，并且该类测定所测模板均含较低的拷贝数，所以结果的可靠性高度依赖于准确的移液操作，在执行该操作时必须注意确保最高的精确度。注意以下步骤:

始终在使用前确保试剂和样品完全解冻和彻底混合。解冻和混合后，短暂离心以去除管壁上的液滴。
高浓度的DNA溶液可能粘性较大，因此很难进行小体积移取。要避免在样品制备过程中一次性做出倍数非常大的稀释操作(如大于100倍)。如样品确需稀释倍数较大，才能达到检测的范围，要进行多次梯度稀释。(例如若需进行10000倍稀释，要连续进行两次100倍稀释，而不是一次性10000倍稀释)。