ONT Direct RNA全长转录组测序

真核基因通常产生多种RNA异构体（isoform），可以产生功能上不同的蛋白质变体。传统二代测序实际上是一种短读长RNA-seq，难以获得完整的转录本，无法体现异构体的多样性。

表观生物推出ONT Direct RNA全长转录组测序服务，基于Oxford Nanopore公司的纳米孔测序平台，直接对RNA进行测序，具有长读长的优势，提高对异构体的检测，还能直接检测m6A、假尿嘧啶pseudoU等核酸修饰，在可变剪切研究方面具有独特的优势。一次测序，即可满足多项表观遗传转录组研究需求，大大提升研究的高度、深度、准确性、效率，尤其适用于多组学分子机制及珍贵的临床样本研究。

  技术应用

1. 对单个RNA分子进行单分子水平的全长测序
2. 识别更长的转录本，研究转录异构体
3. 绘制转录组上的m6A修饰图谱，分辨率可达到单位点
4. 检测RNA可变剪切的情况

  技术优势
1. 作为长读长测序技术，能减少短读长测序打断后重新拼接带来的歧义，结果准确度更高、更可信；
2. 能够直接对RNA进行测序，避免逆转录和PCR扩增导致的RNA修饰信息缺失；
3. 可以直接检测m6A等碱基修饰，配合优化的算法，获得无损的m6A单碱基分辨率图谱；
4. 一次测序，多套数据：转录组图谱、m6A修饰图谱、异构体、可变剪切情况，节省珍贵的临床样本，节省样本准备时间和精力，且保持了样本的统一性。

 

送样要求

1. 细胞，1x10⁷个细胞/每样本；
2. RNA，＞20 ug。

 

ONT RNA直接测序研究方案

  分析流程

 

  分析内容

一、isoform分析
1. 可变剪切分析
2. 融合基因鉴定
3. SSR分析
4. LncRNA分析
5. PolyA分析
二、表达定量
1. 转录本定量
2. 转录本差异分析
3. 富集分析
4. 蛋白质互作网络
三、甲基化修饰分析
1. m5C位点注释
2. m6A位点注释
3. 甲基化修饰富集分析
4. m5C差异分析
5. m6A差异分析
四、isoform联合定量表达分析
1. AltTP分析
2. 功能多样性分析（FDA）
3. 差异富集分析

五、新生mRNA分析

1. 识别新生mRNA
2. 新生mRNA半衰期分析
3. mRNA稳定相关性分析
4. 新生mRNA差异分析

 

结果示例

图1. 不同basecalling模式下Q值的比较。单分子测序原始reads的中位准确率高达98.8%

 

图2. 同时分析m6A和pseudoU，识别准确率分别为97.1%和97.6%

表观生物实测数据

RNA直接测序能够直接鉴定出转录本的可变剪切、RNA修饰、可变剪切位点（AS）、可变聚腺苷酸化位点（APA）、可变转录起始位点（TSS）和mRNA结构上的变异，如图1所示我们能直接观察到在两种条件下RNA直接测序数据在各种结构上的整体差异，进一步锁定研究方向。      

RNA直接测序将数据相比二代测序直接定位到转录本水平，而非基因水平，图2显示了在转录本水平上的表达差异分析结果，找到在基因中差异表达的转录本。      

将在基因水平和转录本水平上找到差异isoform进行GO富集，比较该富集在基因水平和转录本水平的占比，精确找到该富集的影响因素。  

RNA直接测序能够直接检测mRNA上的甲基化修饰如：m6A和m5C，并将甲基化修饰精确定位到该转录本的单碱基位点，如图4所示展示了m6A修饰的整体分布情况。
   

RNA直接测序将检测到的m6A甲基化修饰定位到isoform的单碱基位点，如图5可对比两种条件下的m6A修饰总体变化。  

RNA直接测序同时检测多维度信息，如图6所示，我们将鉴定的m6A单碱基位点、isoform可变剪切位点、isoform定量和isoform与参考基因组比对结果在IGV中查看；如图所示RNA直接测序检测到了该全长转录本约3000bp长度，并在第1262位A碱基上检测到了两种条件下具有差异的m6A修饰，通过图6我们能看到在control组中和treat组中m6A修饰对isoform的影响。RNA直接测序技术同时获得多维数据，将更有利于发现新的现象。

 

 

  案例：

RNA直接测序应用于鉴定内源转录本异构体的m6A修饰

为了将RNA直接测序应用于单位点分辨率的RNA修饰从头测序，研究员研发了利用纳米孔RNA直接测序的m6A鉴定软件（MINES），对HEK293T细胞转录本进行了分析，鉴定超过13,000个之前未注释的DRACH位点的m6A甲基化状态；还在人乳腺上皮细胞（包括异构体）中鉴定得40,000个位点，这些位点分别对m6A writer、METTL3、eraser、ALKBH5敏感。以上数据表明，纳米孔RNA直接测序鉴定m6A修饰的效果优异。

 

纳米孔测序能从DRACH motif中检测出m6A修饰

原文：DANIEL A. LORENZ, et al. Direct RNA sequencing enablesm6A detection in endogenous transcript isoforms at base-specific resolution. RNA(2020) 26:19–28.