原代细胞分离和培养

一、技术简介

原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

二、实验流程

（一）机械分散法 （二）消化分离法
1．酶消化分离法（过夜冷消化法）

细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。

再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。

次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。

加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

2．非酶消化法（EDTA消化法）
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
 
（三）原代细胞培养
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

（四）原代细胞的传代、保存
（1）传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。
（2）保存：DMSO＋培养液＋血清
按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃  过夜）→液氮。

（五）原代细胞的复苏
（1）取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
（2）吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
（3）用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。
人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至1mm³的组织块，再采用如下方法进行原代细胞分离培养：


三、服务说明及结果
1. 客户提供：原代培养所需的细胞（或公司代为分离）和细胞培养试剂。
2. 公司提供：基本实验步骤、原代细胞。
3. 实验周期：10-20个工作日。