悬浮细胞专用腺病毒

一、腺病毒的存储、稀释

        1.收到汉恒生物腺病毒产品后，请先对腺病毒产品进行分装处理，建议50 μl/管。如3天内使用，则留足够量病毒4 ℃保存，余下腺病毒置于-80 ℃长期保存。

2.腺病毒可以存放于-80 ℃ 6个月以上；但如果腺病毒储存时间超过 6个月，建议在使用前重新测定腺病毒滴度。

3.腺病毒是DNA病毒，相对慢病毒这类RNA病毒稳定得多。反复缓慢冻融腺病毒5-6次对10⁹ PFU/ml滴度以上腺病毒滴度无显著影响。但注意要在冰上融化腺病毒，而不能放在37 ℃。持续多次的冻融仍会降低腺病毒滴度。

 

二、悬浮细胞专用腺病毒实验策略与关键知识点

1.悬浮细胞专用

汉恒生物开发的悬浮细胞专用腺病毒针对悬浮细胞的细胞膜特性进行了腺病毒的改造，病毒感染体系也进行了相应的优化，极大改善对悬浮细胞的感染能力。对贴壁细胞的感染能力无影响，可以通用。

2. 超强感染效率

汉恒悬浮细胞专用腺病毒对Jurkat、K562等众多悬浮培养细胞系感染效率接近100%，对血液来源原代细胞，如CD4⁺ T细胞感染效率可达60%以上。

3.腺病毒的细胞感染特性：

1）腺病毒不插入细胞基因组，不形成稳定转染；

2）腺病毒的瞬时表达能力一般为2-4周，细胞增殖越快，表达时间越短；

3）由于不会随机插入损伤基因组，相比较慢病毒，腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小，因此可以用较高MOI来感染目的细胞。

4）高滴度：汉恒生物提供的腺病毒产品滴度较高，由于采用了汉恒特有的体系，用于细胞感染级别的腺病毒一般可以达到10¹⁰ PFU/ml滴度。

 

4.腺病毒细胞实验策略：

由于腺病毒的非稳转性、低离体细胞毒性以及高滴度，应用腺病毒感染细胞的一般策略是：先扩增足量的目的细胞，然后用腺病毒载体感染目的细胞，待目的基因表达后直接进行后续的细胞功能性实验。一般不会用腺病毒先感染细胞后再对细胞进行二次扩增放大化培养。

 

5.悬浮细胞专用腺病毒感染实验相关知识点

1）悬浮细胞准备：腺病毒建稳转细胞系前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。腺病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

        腺病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别。对于悬浮细胞，腺病毒MOI一般以30, 100, 300, 1000, 2000的比例递增进行梯度摸索，相比于贴壁细胞，悬浮细胞的腺病毒MOI需求更高，MOI梯度摸索建议用96孔板进行以节省病毒和细胞。

3）MOI对应病毒体积的换算（非常重要!）

    感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度

    比如第一天传代1×10⁴细胞到96孔板一个孔，第二天长到2×10⁴细胞，按照MOI=500计算，需加入病毒总量为2×10⁴×500=1×10⁷个病毒粒子，按照腺病毒1×10¹⁰   PFU/ml的滴度，则加入的病毒体积数为(1×10⁷)/(1×10¹⁰   PFU/ml)=1×10^-3 ml=1 μl。

 

三、腺病毒感染细胞步骤

 

1.感染前准备

        1）按实验需要将悬浮细胞铺板（比如96孔板）37 ℃ 培养过夜。细胞数以第2天密度约40%～60%间为宜。

        2）从冰箱取出悬浮细胞专用腺病毒并在冰上缓腺融化，待完全融化后开始病毒感染实验。

 

2. 目的细胞的感染

吸去细胞原有培养基，加入新鲜培养基，选定MOI值换算对应的病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀。封好口，放入平角离心机后，低速（500g）离心1.5h，然后放入37℃培养箱中继续积感染4小时。

1) 37 ℃培养箱中感染完毕后，取出细胞，吸去含病毒的培养液，换上新鲜培养基，继续37℃培养。

2)感染48小时后，荧光显微镜检测GFP/RFP等荧光表达效率。对于部分悬浮细胞，荧光表达较慢，需待96小时后才会有明显荧光

 

 

悬浮细胞专用病毒感染实例

病毒：悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP，1×10¹⁰   PFU/ml

感染细胞：Jurkat、K562、HL-60、L2110

感染方式：MOI=500

检测方法：感染72H后荧光显微镜检测