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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存:
30
- 英文名:
详见说明书
- 保质期:
详见说明书
- 供应商:
上海研生
- 保存条件:
低温冷藏
- 规格:
1包
英文名称:
产品规格:1
发货周期:1~3天
产品保存4℃保存,半年有效
产品特点
1.相容性好,可用于其它的免疫检测封闭。
2.快速。
3.高信噪比,背景更干净。
实验报告:
一、分离与培养:
1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小;
2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置;
3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;
二、免疫荧光鉴定:
1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%在室温条件下固定细胞15min;
2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗,然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗, 37℃条件下放置1h;
6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
培养操作步骤:1.酪蛋白PBS缓冲系统封闭液(干粉)说明书用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出,用无菌丝绸布擦拭干净,不要用纱布;
2.将盖玻片轻轻放入6孔培养板(每孔一片)或培养皿中(每个平皿可放置2-3片);
3.在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时;
4.将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中,使盖玻片完全浸在培养液中;
5.将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天,当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时,将培养板取出,用盖片镊轻轻取出盖玻片,用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。
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注意事项:
尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响,但为取得良好的使用效果,3-6个月内推荐4℃保存,并适当注意避免反复冻融。
如果有细菌或真菌污染,会严重影响检测效果。
染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
如果细胞收集过程中使用了胰酶,需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC,导致染色失败。
荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
用于流式细胞仪检测时,如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞,并且通过调整相关设置和参数也无法改善,可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测,这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
需自备PBS。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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文献和实验注意事项 1.认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。2.配制是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。3.配制所用的水应是三蒸水,离子浓度很低。4.所用器皿应严格消毒。5.配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4度。6.液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基,它是一种灭菌后保证无菌的溶液,必要时可制成无内毒素
. (Positive pressure recommended)*pH unite will usually rise 0.1-0.3upon filtration.另外,在李玲、李雪峰编著的《细胞生物学实验》(湖南科学技术出版社)中配制方法如下: 1、制备新鲜三蒸水或Millipore超纯水。 2、称取所需量的干粉培养基,加入约终体积一半的三蒸水中;若配制一个包装的培养液,在将整个包装的干粉倒入三蒸水后,需用水洗包装袋内面2次,倒入培养液中,以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解
1、保存在2-8度干燥环境,避光。 2、称量出比最终容积小5%的蒸馏水,混合的容器尽可能接近最终容积。 3、将干粉加入到室温15到30度的水中,轻柔搅拌,勿用热水。 4、冲洗出包装袋内所有干粉。 5、每升培养基加入2.2g碳酸氢钠。 6、用水稀释至最终的容积,搅拌直至溶解。不要过分混合。 7、调整pH值比最后的培养用的pH值要低0.2到0.3(过滤后pH值一般要升高0.1到0.3):用1N NaOH 和 1N HCl,边搅拌边缓慢添加。调整pH值完毕后,封闭容器,直至过滤
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