FS Mix Direct for tissue

FS Mix Direct for tissue

产品简介

FS™ Mix Direct for Tissue是适合组织样本扩增的2×浓缩快速高效PCR预混合溶液，含有FS™ Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分（模板与引物除外）。使用时，仅需在扩增体系中加入简单处理后的样本处理液和引物即可进行PCR，从而可以极大地简化操作过程，缩短操作时间，降低污染（加样次数减少）。FS™ Mix Direct for Tissue的反应体系经过优化处理，高灵敏度的FS™ Taq DNA聚合酶确保处理液中的微量样本得到高效扩增。本产品不用进行繁琐的DNA提取，最大限度减少实验误差和交叉污染；同时依靠特殊的缓冲体系增强PCR扩增的特异性，保证扩增效果与DNA模板扩增效果同样可靠。

FS™ Taq DNA聚合酶是根据蛋白工程原理，以Taq DNA聚合酶为基础，研发设计的新一代DNA聚合酶。本产品具有类似KOD酶的快速扩增能力，延伸速度为20s/kb（70~75℃，简单模板可达5s/kb）。是普通Taq DNA聚合酶的3倍，可缩短一半以上的扩增时间；同时具备Taq DNA聚合酶扩增效率高、适应性广等优点。FS™ Taq DNA聚合酶使用方法与普通Taq DNA聚合酶基本相同，只需注意适当缩短延伸时间。该酶具有5'→3'聚合酶活性，无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA突出端，可直接用于TA克隆。

产品组成

Component	ZY2071b	ZY2072b
2× FS™ Mix   Direct for Tissue	1 ml	1 ml× 5
超纯水	1 ml	1 ml× 5
Neutralization    Solution	1 ml	5 ml
Extraction    Solution	10   ml	40   ml

本产品分体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品，PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如无特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测：PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 处理样品

组织：取3-5mg组织置于1.5ml离心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分涡旋振荡，95℃温浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分涡旋振荡，5,000rpm离心2min，取0.5-2 μl上清进行扩增。

头发：取两根带毛囊的头发，剪下带毛囊的发根放入1.5ml离心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分涡旋振荡，95℃温浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分涡旋振荡，5000rpm离心2min，取0.5-2 μl上清进行扩增。

口腔拭子：取样前30min内请勿进食及饮水，使用无菌棉签在口腔内擦拭10次。将棉球剪下置于1.5ml离心管中，加入180 μl Extraction  Solution，充分涡旋振荡，95℃温浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分涡旋振荡，5,000rpm离心2min，取0.5-2 μl上清进行扩增。

培养细胞：如果是悬浮培养细胞直接取1×10³-10⁴当量的细胞加入到50 μl PCR反应体系中即可。如果是贴壁培养细胞，取3-5mg细胞组织置于1.5ml离心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分涡旋振荡，95℃温浴10min。加入20 μl Neutralization Solution，充分涡旋振荡，5,000rpm离心2min，取0.5-2 μl上清进行扩增。

血液、淋巴液DNA病毒：取100 μl血清或淋巴液至1.5ml离心管中，加入180 μl Extraction Solution，充分涡旋振荡，95℃温浴10min。加入20 μl Neutralization  Solution，充分涡旋振荡，12,000rpm离心10min，取0.5-2 μl上清进行扩增。

2. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：

Ordinal	Component	Volume (50 μl reaction volume)	Final   concentration (50 μl reaction volume)
1	2× FS™ Mix   Direct for Tissue	25   μl	1×
2	upstream   primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4   μM
3	downstream   primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4   μM
4	处理液上清	0.5-2   μl	<1μg
5	超纯水[2]	To 50   μl	-
optional	MgCl2(MgSO4)/PCR   Enhancer[3]	Variable	-

[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。

[2] 可单独订购超纯水。

[3] 可单独订购25mM MgCl₂和PCR Enhancer。

3. 设定反应程序进行PCR反应

大多数模板的快速扩增条件：

Stage	Temperature	Time	Number   of Cycles
Initial   Denaturation	94℃	3   min	1
Denaturation	94℃	30   sec	28-40
Annealing	55-68℃[1]	30   sec
Extension	72℃	Variable[2]
Final   Extension	72℃	2   min	1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按20 sec/kb来设最佳。

1kb简单模板的快速扩增条件：

由于1kb简单模板的二级结构简单，且长度较短，可同时缩短变性、退火时间至15s，延伸时间20s，以实现快速扩增。

4. 分析结果

反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要，可进行割胶回收。无产物或产物量少的改进措施有：1调整退火温度；2减少抑制剂的影响，如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分，需要高倍稀释（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脱，提高模板DNA的纯度；4使用PCR添加剂，如PCR Enhancer、MgCl₂等可提高产量。

操作注意事项

处理的组织样本往往不会完全溶解，这是正常现象。溶解在处理液中的组织样本足够满足FS™ Mix Direct for Tissue扩增的需要。

室温下FS™ Taq DNA聚合酶有一定的活性，为避免发生非特异性扩增，请于冰上配置反应体系，并且最后添加模板DNA。

延伸时间视片段长度而定。一般情况，≤500bp目的片段延伸15s，500bp-1kb延伸20s，＞1kb延伸时间按20s/kb计算。

FS™ Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性，因此在PCR产物3’末端通常会加上一个多余的脱氧腺嘌呤核苷，可进行TA克隆。

FS™ Mix Direct for Tissue也可采用常规程序扩增。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间；上下游引物3’末端避免互补，避免出现3个以上重复的G或C，或出现发夹结构，否则会产生非特异性扩增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量尽量接近；Tm值控制在55-65℃之间，且上下游引物Tm值尽量接近，额外附加序列（酶切位点、修饰等）是非模板匹配序列，不参与Tm值计算。