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Pfu DNA高保真聚合酶
-20℃保存2年
上海泽叶生物科技有限公司
-20℃
盒
产品简介
Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达5 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70~75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,扩增产物具有平末端。
产品组成
Component |
ZY1021 250U |
ZY1022 250U |
ZY1023 1,000U |
ZY1024 1,000U |
Pfu DNA聚合酶(5U/μl) |
50 μl |
50 μl |
200 μl |
200 μl |
10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)[1] |
1.25 ml |
1.25 ml |
1.25 ml × 2 |
1.25 ml × 2 |
6× Loading Buffer[2] |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
dNTPs(2.5mM)[3] |
- |
1 ml |
- |
1 ml × 2 |
[1] 10× Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装,可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2。
[2] 6× Loading Buffer,如有需要可单独购买(Cat. #:M9041)。
[3] dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩尔混合物,P1021/P1023不含dNTPs,如有需要请单独购买(Cat. #:P9011/P9012/P9013)。
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存2年。
质量控制
纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final concentration (50 μl reaction volume) |
1 |
10× Pfu Buffer(Mg2+Plus) |
5 μl |
1× |
2 |
dNTPs(2.5mM) |
4 μl |
0.4 mM |
3 |
upstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
4 |
downstream primer (10 μM)[1] |
2 μl |
0.4 μM |
5 |
Pfu DNA聚合酶(5U/μl)[2] |
0.5 μl-1 μl |
2.5U-5U |
6 |
template DNA[3] |
1-4 μl |
<1μg |
7 |
超纯水[4] |
To 50 μl |
- |
optional |
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5] |
Variable |
- |
[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。
[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。
Template |
Dosage |
人类基因组DNA |
0.1μg-1μg |
λDNA |
0.5ng-5ng |
大肠杆菌基因组DNA |
10ng-100ng |
质粒DNA |
0.1ng-10ng |
[4] 可单独订购超纯水。
[5] 可单独订购25mM MgCl2和PCR Enhancer。
2. 设定反应程序进行PCR反应
Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
Denaturation |
94℃ |
30 sec |
25-35 |
Annealing |
55-68℃[1] |
30 sec |
|
Extension |
72℃ |
Variable[2] |
|
Final Extension |
72℃ |
5-10 min |
1 |
[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。
[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。
3. 分析结果
将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。
无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2)等可提高产量。
操作注意事项
1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。
2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)
PCR(纯化)产物 |
1-7 μl |
10× Taq Buffer(Mg2+Plus) |
1 μl |
dATP |
0.2 mM |
Taq DNA聚合酶 |
5U |
超纯水 |
To 10 μl |
3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。
4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。
引物设计注意事项
引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。
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