Pfu DNA高保真聚合酶

Pfu DNA高保真聚合酶

产品简介

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达5 kb（简单模板）。延伸速度为2min/kb（70~75℃，简单模板可达20s/kb）。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，扩增产物具有平末端。

产品组成

Component	ZY1021 250U	ZY1022 250U	ZY1023 1,000U	ZY1024 1,000U
Pfu DNA聚合酶（5U/μl）	50 μl	50 μl	200 μl	200 μl
10× Pfu   Buffer（Mg2+ Plus）[1]	1.25 ml	1.25 ml	1.25 ml × 2	1.25 ml × 2
6× Loading Buffer[2]	1 ml	1 ml	1 ml	1 ml
dNTPs（2.5mM）[3]	-	1 ml	-	1 ml × 2

[1] 10× Pfu Buffer分为Mg²⁺ Plus与Mg²⁺ Free两种包装，可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg²⁺ Plus)。Mg²⁺ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl₂。

[2] 6× Loading Buffer，如有需要可单独购买（Cat. #：M9041）。

[3] dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩尔混合物，P1021/P1023不含dNTPs，如有需要请单独购买（Cat. #：P9011/P9012/P9013）。

活性定义

一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测：PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：

Ordinal	Component	Volume (50 μl reaction volume)	Final   concentration (50 μl reaction volume)
1	10× Pfu   Buffer（Mg2+Plus）	5 μl	1×
2	dNTPs（2.5mM）	4 μl	0.4 mM
3	upstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
4	downstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
5	Pfu DNA聚合酶（5U/μl）[2]	0.5 μl-1 μl	2.5U-5U
6	template DNA[3]	1-4 μl	<1μg
7	超纯水[4]	To 50 μl	-
optional	MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]	Variable	-

[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建议用量如下表（50 μl反应体系）。

Template	Dosage
人类基因组DNA	0.1μg-1μg
λDNA	0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA	10ng-100ng
质粒DNA	0.1ng-10ng

[4] 可单独订购超纯水。

[5] 可单独订购25mM MgCl₂和PCR Enhancer。

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage	Temperature	Time	Number of Cycles
Initial Denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	30 sec	25-35
Annealing	55-68℃[1]	30 sec
Extension	72℃	Variable[2]
Final Extension	72℃	5-10 min	1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳（简单模板可达20s/kb）。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要，可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有：1调整退火温度；2减少抑制剂的影响，如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分，需要高倍稀释（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脱，提高模板DNA的纯度；4使用PCR添加剂，如PCR Enhancer、MgCl₂）等可提高产量。

操作注意事项

1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性，为避免发生非特异性扩增，请于冰上配置反应体系，并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端，可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆，请先进行加A反应，以提高克隆效率。（加A反应：参考如下体系，72℃，15-30min）

PCR（纯化）产物	1-7 μl
10× Taq Buffer（Mg2+Plus）	1 μl
dATP	0.2 mM
Taq DNA聚合酶	5U
超纯水	To 10 μl

3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10^-6。

4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间；上下游引物3’末端避免互补，避免出现3个以上重复的G或C，或出现发夹结构，否则会产生非特异性扩增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量尽量接近；Tm值控制在55-65℃之间，且上下游引物Tm值尽量接近，额外附加序列（酶切位点、修饰等）是非模板匹配序列，不参与Tm值计算。