cDNA第一链合成试剂盒（改良M-MLV)

特别提示：包括cDNA第一链合成试剂盒（改良M-MLV)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：cDNA第一链合成试剂盒（改良M-MLV)
英文名称：BaiScript Ⅱ RT Kit
产品货号：WH0099
产品规格：25次|100次

本试剂盒适用于二级结构复杂和长链cDNA合成。提供了所有的用于cDNA第一链合成的试剂，其中的BaiScriptⅡ RTase为改良后的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV），改良后的新RTase具有更高的模板亲和力和更低的RNase H活性，因此使其在cDNA第一条链的合成过程中具有通读复杂二级结构模板和反转录长片段cDNA的能力。产品中配备的5×BaiScriptⅡ RTase Buffer经过精心的优化，既保证了新型RTase的高效酶活，又拓宽了RNA模板量的加入范围，使得反转录出来的cDNA具有更好的质量以便用于后续的实验分析。

产品特点：
·酶活效率高：高效的反转录酶活性，后续实验兼容性好。
·底物范围广：适用于所有RNA，尤其是具有复杂二级结构的RNA模板。
·反转片段长：cDNA第一链合成可以达到12 kb。

产品应用：
· cDNA第一链的合成；
· cDNA文库的构建；
·一步法RT-PCR；
· RACE分析。

使用实例：

本试剂盒对不同长度片段的反转录能力
实验材料：人类贴壁细胞总RNA。RT-PCR起始量：20μl反转录产物（50ng/μl)
实验结果：以上为1μg总RNA反转录后取2μl反转录产物进行10个长度不同的目标基因的扩增图
扩增体系：20μl
上样量：5μl
电泳条件：6V/cm，20min
各泳道图示：
1：产物长度120bp；2：产物长度1.0kb
3：产物长度2.5kb；4：产物长度3.2kb
5：产物长度4.6kb；6：产物长度6.8kb
7：产物长度7.6kb；8：产物长度8.9kb
9：产物长度10 kb；9：产物长度12 kb

试剂盒组成：

组分	25次	100次
BaiScript II RTase （200U/μl)	25μl	100 μl
Oligo （dT)15（10μM)	60 μl	240 μl
Random （10μM)	60 μl	240 μl
5×BaiScript II RTase Buffer	150 μl	500 μl
RNase-free ddH2O	1ml	2×1ml
Super Pure dNTPs （10mM,each)	30 μl	120 μl
RNasin （40 U/μl)	15 μl	2×30 μl

储存条件：-20℃可保存一年。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行滤除菌处理。
2．RNA样品要避免基因组DNA污染；
3．避免反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态；
4．试剂盒中各组分成分应在-20℃保存；
5．在使用Random Primer时，要注意随机引物量和总RNA量之间的关系，一般建议50ng随机引物/5μg总RNA。当提高Random/RNA的比率将会提高短片段（～500 bp）cDNA的合成；而当降低Random/RNA的比率将会提高长片段cDNA的合成；
6．如果模板RNA富含二级结构，可以先在65℃条件下处理5min；
7．如果反转录中使用PCR下游引物，为了防止引物错配导致的非特异扩增，可以在50℃条件下进行反转录；
8．在进行长片段扩增时，为了防止cDNA结果被破坏，建议以70℃下处理15min为酶灭活条件；
9．当使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部，由于酶粘度高，吸取时应慢慢吸取。
10．如果要扩增长片段，需使用新鲜提取所得的完整性好、纯度高的RNA。

操作步骤：

1．将模板RNA在冰上解冻；引物、5×BaiScriptⅡRTase Buffer、Super Pure dNTPs混合液和RNase-free ddH2O在室温（15-25℃）条件下解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
2．按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液：
  表1：gDNA去除反应体系

加入物	加入量
RNA	1 ng~2μg Total RNA 或1pg~2 ng Poly（A) mRNA
Primer	2 μl Oligo-dT（10μM) 或2 μl Random Primer（10μM) 或10～15 pmole基因特异性引物
Super Pure dNTPs （10mM)	1 μl
RNase free H2O	补充至14.5 μl

3．65℃孵育5 min，然后置于冰上2 min。
4．在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分：

加入物	加入量
上述反应液	14.5μl
5×BaiScriptⅡRTase Buffer	4μl
RNasin （40 U/μl）	0.5μl
BaiScriptⅡRTase（200U/μl）	1μl

5．如果引物为Random Primer则需将体系现在25℃下孵育10 min，如果引物为Oligo-dT和基因特异性引物则不需要此步骤。
6．42℃孵育60 min。
7．85℃加热5 min（或70℃加热15min）终止反应，置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

除了cDNA第一链合成试剂盒（改良M-MLV),，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
ZN0052	alpha-synuclein mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0091	Aromatase mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0112	AXIN2 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0199	Caspase-8 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0216	CBP/P300 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0512	FGF9 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0669	HOTAIR mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0684	HSP105 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0750	Integrin-α3/ITGA3 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0781	Interleukin 4Rα/IL-4Rα mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0844	LFABP mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1061	P130 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1402	TLR15 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN1407	TLR8 mRNA原位杂交试剂盒	100T