miRNA cDNA第一链合成试剂盒库存

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名称：miRNA cDNA第一链合成试剂盒库存
产地：国产|进口
规格：25次
品牌：百奥莱博
本试剂盒采用在miRNA 3´末端加多聚A 尾的方法来使miRNA 具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Tag引物进行逆转录反应，最终合成miRNA 对应的第一链cDNA。其反应流程如下：


产品特点：
1. 两步式操作，先进行Poly(A)加尾，再进行逆转录反应。
2. 只需要1μg的total RNA。
3. 所得cDNA可用于检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。
4.与miRNA荧光定量PCR 检测试剂盒兼容。
5.特异性好，独特的miRNA引物及反应体系避免了Pre-miRNA的非特异扩增。

试剂盒组成：

 

成分	规格
E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	10μl
10×Poly(A)聚合酶反应液	50μl
ATP溶液，1mM	50μl
Oligo(dT)-Tag引物(0.5ug/μL)	25μl
MMLV 逆转录(含RI)	50μl
4×RT Buffer(含dNTP)	125μl
RNase-free 水	1ml

储存条件：低温运输，-20℃保存。

使用方法：

一、对miRNA 3´末端进行加Poly(A)处理
1.在冰上预冷RNase-Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μL。注意需要最后加入E.coli Poly(A)聚合酶。

试剂组份	体积
自备的Total RNA(见注)	1μg
10× Poly(A)聚合酶反应液	2μl
ATP溶液，1mM	2μl
RNase-Free水	补水至20μL
E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	0.4μL(2U)

注：在反应中使用的Total RNA必须含有miRNA。也可以直接使用miRNA(建议加入量为2–5μL，需根据目的miRNA的丰度决定)。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60 min。所得的反应液可以直接进行下游实验(注意：只能把2μL 直接用于后续的RT反应，多于2μL 则需要先乙醇-乙酸*沉淀，再将加尾后的miRNA 溶于水，然后再取所需量用于RT。如果不经过沉淀，带入的残留的poly(A)聚合酶反应液将会干扰RT反应)，也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。

二、对带Poly(A)尾巴的miRNA进行逆转录反应
3. 按照下表设置20μL体系的RT反应：

成分	体积
Poly(A)反应产物(来于上步)	2μl
RNase-Free水	10μl
Oligo(dT)-Tag引物	1μl
4×RT Buffer(含dNTP)	5μl
MMLV 逆转录酶(含RI)	2μl

4. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60 min。
5. 70℃保温10 min 终止反应。
6. 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以暂时冰上放置，立即用于后续的荧光PCR 定量检测，不需要纯化。

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