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IP 和Co-IP服务
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MDL-百奥思科
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免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
优点
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
(4)灵敏度没有亲和色谱高。
服务要求
提供新鲜样本材料和IP及WB的一抗(或由我公司代购)
注:免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
服务基本流程
1. 裂解样品,准备蛋白样品;
2. 准备抗体-Protein A/G beads;
3. 样品,抗体-Protein A/G bends共孵育;
4. 洗脱;
5. WB检测。
服务报告内容
WB结果和实验报告。
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文献和实验某个实验间隙… 萌新:开题报告已提交,转眼 1 个月过去了,实验还是一头雾水,为啥我的 co-IP 拉不下来蛋白? 奋斗中的师兄:我当初正好相反,拉下来的蛋白被抗体条带覆盖住了,换个抗体忒不好找,无奈换了个蛋白,还好挺顺利。 大师兄:蛋白吧,不但种类多,理化性质差异较大,关键它们又喜欢组队在细胞里干活,IP、co-IP 又是常用的手段,掌握好这个工具还是很重要的,总不能随随便便就换个蛋白。 那要怎么快速掌握这项实验,轻松搞定各种疑难杂症呢? 我们依据三十多年的 IP/co-IP 实验经验,总结
紫叶竹韵 做IP,之后Western 分析,看到有两条带,在25和50KD左右,应该是抗体的两条带,但是我的目的蛋白也是52KD的,这该怎么区分呢。 woxingwosu 最好是选择与做IP不同来源的抗体来做(比如说IP用鼠的抗体,WB就用兔的抗体),这样就不会检测到抗体的两条带。 如果没有不同来源的抗体的话,就要做IP的时候尽量少放点抗体,跑胶跑得远一点,使得目的蛋白能够被看到,不过由于你的蛋白是在是太接近重链
一、原理: 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,基本原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体Fc段结合的proreinA/G(预先结合固化在琼脂糖小珠上),形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物,纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白,应用Westernblot或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。 与其它研究方法相比,免疫
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