支原体检测试剂盒(巢式PCR法)现货供应

特别提示：包括支原体检测试剂盒(巢式PCR法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：支原体检测试剂盒(巢式PCR法)
英文名称：Mycoplasma PCR Detection Kit
产品货号：YT986
产品规格：20μL×250次

本试剂盒利用两对引物通过巢式PCR法特异性扩增支原体基因组DNA片段，从而实现对支原体的高灵敏度特异性检测的。原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区(space region)在各种生物种间的碱基序列差别很大，如16S和23S之间的间隔区。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种属间既有非常保守的部分，也有较大差异的部分。在编码16S和23S的保守区DNA上设计一对F1/R1引物，用于扩增16S和23S之间的间隔区，这就是巢式PCR的第一轮PCR(1st PCR)，用于初步鉴定是否有支原体污染；然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条F2引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条R2引物进行巢式PCR的第二轮PCR(2nd PCR)。通过巢式PCR可以大大提高检测的特异性和灵敏度。本产品的检测原理请参考图1。

图1.支原体检测试剂盒(巢式PCR法)的检测原理图。
试剂盒可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。
本试剂盒提供了阳性对照Control template，便于确定PCR检测是否能正常工作，及样品中是否存在抑制PCR反应的物质。
如果发现有支原体污染，建议更换无污染的细胞进行培养。如果有必要预防或去除支原体，可以使用专用的支原体预防或去除试剂

试剂盒组成：

组分	规格
1st PCR Primer Mix(50X)	100μL
2nd PCR Primer Mix(50X)	100μL
Control template	100μL

保存条件：-20℃保存。

注意事项：
1．由于PCR反应非常灵敏，可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Taq酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
2．一般情况，1st PCR可以初步鉴定是否有支原体污染，但建议进行2nd PCR以进一步确认。
3．本试剂盒不能检测出人肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。
4．本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
5．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1．实验前的准备工作：
a．需要用户自己准备的器材
(a)PCR扩增仪。
(b)琼脂糖凝胶电泳装置。
(c)微量离心机。
(d)无菌PCR管、离心管、枪头及移液枪。
b．试剂和检测样品准备
(a)双蒸水或超纯水。
(b)2×PCR Master Mix(货号：YT378)、2×PCR Master Mix（含染料）(货号：YT382/YT383/YT384)或者其它Taq酶及PCR所需的dNTP等。
(c)琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、DNA分子量标准、电泳染料。
(d)样品：用于检测支原体污染的样品是细胞接种后培养了3-6天的培养上清液，或者是培养液、血清；如果使用细胞悬液做样品，则需要提取DNA后再进行PCR。加入量一般为反应体系1/10的量或更少。

2．1st PCR反应：
a．融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将2×PCR Master Mix，例如2×PCR Master Mix(YT383)置于冰浴上或冰盒内。参考下表在冰浴上设置PCR反应：

试剂	终浓度	20μL体系	50μL体系
双蒸水或超纯水	-	7.6-9.2μl	19-23μl
检测样品(DNA)或Control template	0.2pg/μl -20ng/μl	0.4-2μl	1-5μl
1st PCR Primer Mix(50X)	1X	0.4μl	1μl
2×PCR Master Mix(YT383)	1X	10μl	25μl
总体积	-	20μl	50μl

注：Control template的推荐用量为1μl。
b．PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
STEP1(起始变性):94℃ 30sec
STEP2(变性):94℃ 30sec
STEP3(退火):55℃ 2min
STEP4(延伸):72℃ 1min
STEP5(循环):Go To STEP2 for 30-35 cycles
STEP6(最终延伸):72℃ 5min
STEP7(临时保存):4℃ forever

3．2nd PCR反应：
a．参考下表在冰浴上设置PCR反应：

试剂	终浓度	20μL体系	50μL体系
双蒸水或超纯水	-	9.4μl	23.5μl
1st PCR产物	0.2pg/μl -20ng/μl	0.2μl	0.5μl
2nd PCR Primer Mix(50X)	1X	0.4μl	1μl
2×PCR Master Mix(YT383)	1X	10μl	25μl
总体积	-	20μl	50μl

b．PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
STEP1(起始变性):94℃30sec
STEP2(变性):94℃30sec
STEP3(退火):55℃2min
STEP4(延伸):72℃1min
STEP5(循环):Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6(最终延伸):72℃5min
STEP7(临时保存):4℃forever

4．扩增产物的电泳分析：
a．反应结束后，取1st PCR及2nd PCR的反应产物各10μl，进行电泳确认扩增有无片段及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果示意图请参考图2。如果实验目的只是确定是否有支原体污染，1-2%的琼脂糖凝胶电泳均可；如果需要确定片段大小并据此大致推测污染支原体的种类，优先推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。

图2.使用本支原体PCR检测试剂盒进行PCR检测时扩增产物的琼脂糖凝胶电泳示意图。1、2、3是1st PCR产物；1#、2#、3#是相应的2nd PCR产物。各泳道的模板分别是：1和1#，Control template；2和2#，支原体污染的细胞上清；3和3#，超纯水。M为DNA
b．以不同种属的支原体为模板，1st PCR及2nd PCR的反应产物的条带大小不同，具体扩增片段大小可参考下表。
本试剂盒确定可以扩增的支原体种类及1st PCR和2nd PCR扩增产物长度参考表：

种属	GenBank编号	1st PCR(bp)	2nd PCR(bp)
Mycoplasma arginini	JN935883	370	145
Mycoplasma arthritidis	AY973560	408	157
Mycoplasma capricolum	AY800346	415	221
Mycoplasma fermentans	AY816338	492	195
Mycoplasma hominis	AY738737	370	148
Mycoplasma hyopneumoniae	JN935889	682	238
Mycoplasma hyorhinis	AY973572	452	211
Mycoplasma neurolyticum	AY796063	502	196
Mycoplasma orale	AY737010	424	179
Mycoplasma pulmonis	JN935865	477	190
Mycoplasma salivarium	AY786574	403	151
Ureaplasma urealyticum	AY741673	482	154

注：本试剂盒主要用于检测是否有支原体污染，但也可以通过1st PCR和2nd PCR扩增产物长度大致预测所污染的支原体种属。如果有必要，也可以对PCR产物进行常规测序以确定具体的支原体种属。

5．关于阳性对照反应：
a．一方面阳性对照Control template可以单独使用，以确定PCR反应体系是否能正常工作。另一方面，阳性对照Control template也可以添加到样品中，以确定样品中是否含有抑制PCR反应的物质。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template时，1st PCR的反应产物是810bp，2nd PCR的反应产物是590bp。
b．如果阳性对照Control template单独使用时没有获得扩增片段，提示PCR检测体系存在问题，需要考虑更换PCR反应相关试剂。
c．如果阳性对照Control template单独使用时获得了预期的扩增片段，而阳性对照Control template添加到样品一起进行PCR扩增反应时没有获得任何PCR扩增产物，提示PCR体系工作正常，但检测样品中存在抑制PCR反应的物质。此时建议将检测样品进行DNA抽提，再用提取的DNA作为模板进行扩增。也可以尝试将样品用超纯水或PBS适当稀释后再进行测试，此时如果样品中支原体的污染程度比较高，基本上不会影响检测，但如果样品中支原体的污染程度比较低，很可能会导致检测灵敏度显著下降。
d．如果阳性对照Control template单独使用时获得了预期的扩增片段，而阳性对照Control template添加到样品一起进行PCR扩增反应时可能仅获得支原体的PCR扩增产物或仅获得阳性对照Control template的扩增产物，也可能同时获得支原体和阳性对照Control template的扩增产物。其中一种模板量比较多时，通常更容易扩增获得哪种模板的PCR扩增产物。其中一种模板特别多时，另外一种模板可能检测不到明显的扩增。

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