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- 沪震生物/HZbscience
- HZ-1030
- 进口/国产
- 2025年07月12日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
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大量
- 英文名：
EGY48 Chemically Competent Cell
- 保质期：
-80℃（6个月）
- 供应商：
上海沪震实业有限公司
- 保存条件：
-80℃（6个月）
EGY48 Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格
EGY48 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGBKT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
基因型
MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2
产品说明
EGY48菌株是Clontech公司开发的LexA系统酵母双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；Transformation marker为：his3，trp1，ura3，报告基因为：LEU2；报告基因UAS (上游激活序列)来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LEU2表达。EGY48-LexA酵母双杂系统系统需要三种质粒配套使用：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，用于表达DNA-BD(来自原核的202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白 (Bait)的融合蛋白；质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，用于表达AD(来自疱疹病毒的88个氨基酸残基组成的B42AD蛋白)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白；报告质粒p8op-LacZ的筛选标志为URA3，报告基因为LacZ，报告基因UAS来源于LexA op(x6)，只有当 Bait和 Prey互作时才能启动 LacZ表达。EGY48感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGBKT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取100 μl冰上融化的EGY48感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5ug，Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10 ul ，PEG/LiAc 500ul并吸打几次混匀，30度水浴30 分钟（15 min时翻转6-8次混匀）。
2. 将管放42度水浴15min （7.5 min时翻转6-8次混匀）。
3. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。
4. ddH2O 50ul重悬，涂板,29℃培养48-96h。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4. EGY48酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培养可见直径1 mm克隆。
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文献和实验体积无水乙醇;1/10体积3.0M NaAc(pH5.2)，于-20℃静置过夜。 13. 离心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。 l)，保存于-20℃。mg/管(用于1次转化反应，约40m14. 干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200 构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞 1. 将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落
Two-hybrid analysis of genetic
bait plasmid and a URA3 lacZ reporter plasmid like pSH18-34.The strain expressing the activation domain-tagged protein (prey strain)is EGY48 (MATa ura3 his3 leu2::3LexAop-LEU2 trp1 LYS2)transformed with the TRP1 prey plasmid.Patches of these two strains
去阳性克隆，保留阴性克隆。3. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆 如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。 质粒1 (in YM4271) 质粒2 (in EGY48) LacZ表型 Leu表型 pLexA pB42AD 白 不能生长 pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长 pLexA pB42AD
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