1M咪唑盐酸缓冲液（PH7.0）

如何提高 HIS 标签蛋白纯化效果

HIS 标签蛋白纯化效果不理想，宝宝心里苦呀。今天，小编来跟大家一起找找原因。 纯化所得组分中没有收集到重组的 HIS 标签蛋白。该问题主要可以分为以下两个方面：    1、HIS 标签蛋白没有结合到填料上就流穿了 原因一  超声的功率不对。超声功率过高，容易导致蛋白炭化；功率过低，蛋白释放不出来。 建议 改变超声功率，同时可以在超声前加入溶菌酶。   原因二 结合缓冲液条件不合适。 建议 检查结合缓冲液中是否有影响结合的因素，如：金属离子螫合剂、强还原剂、过高的咪唑浓度。同时，优化缓冲液

His标签蛋白纯化效果不理想？小贴士来帮你！

一 洗脱条件太温和。 建议 增加咪唑的浓度或选择咪唑线性梯度洗脱，或者通过降低pH寻找最佳洗脱条件。需要注意的是，pH低于3.5容易导致镍离子脱落。 原因二 蛋白柱上沉淀。 建议1 降低蛋白浓度。可以减少上样量，或者采用咪唑线性而非步级梯度洗脱，增加蛋白稀释度。 建议2 试用去污剂或者改变NaCl的浓度，或者使用变性剂（4-6M盐酸胍或4-8M尿素）在变性条件下洗脱。 原因三 非特异性的疏水或者其他相互作用。 建议 加非离子型去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的浓度

一文搞定纯化实验 7 大常见问题！

抗 His 标签的抗体进行 WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱 。 A：若目的 His 标签蛋白流穿 ● 样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。 ● His 标签蛋白与填料的结合较弱：降低上样流速或增加孵育时间；增加标签 His 的数量（常用 6～10 个）。 ● His 标签未充分暴露：在变性条件（4～8 M 尿素或 4～6 M 盐酸胍）下进行纯化或测试；重新构建克隆，改变 His 标签的位置。 ● 尝试其他的金属离子：如 Zn