2×pEC-T vector快速连接预混液

特别提示：包括2×pEC-T vector快速连接预混液在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：2×pEC-T vector快速连接预混液
产品货号：JN0106
产品规格：20次

  Easy Cloning T-vector是一种PCR产物高效TA克隆的专用T载体。它由pBluescript II KS载体改造而成：保留了pBluescript II KS载体全部的酶切位点；PCR产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间，其 两侧都有众多的酶切位点可供选择。
  传统T载体在进行连接时的操作程序是：载体、片段、T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA Ligase。本制品是在传统模式上将除了插入片段的各成分进行预混，并使其在稳定性、转化子数目、阳性率方面 不低于传统模式，使用时只需加入插入片段即可，大大简化了操作过程，降低了配制连接体系过程中的误差和污染率，节省了时间。

产品组成：

组份	规格
2×pEC-T vector快连预混液（10 ng/μl）	100μl*
Control Insert（50 ng/μl）	10μl
附赠
2×Taq MasterMix (快速上样型)	1ml×2
2×Fast Taq MasterMix (快速上样型)	1ml
DNA Ladder 2000 Plus	100μl

*使用时请于冰中融解

产品特点：
高效：提供2×Quick Ligation Buffer快速连接，15分钟即可完成连接反应。
稳定：-20℃取出反复冻融20次，克隆数目及阳性率不受影响。
快捷：只需加入插入片段，在补充去热源水到10μl体系即可，省去了分步取样的繁琐。
便利：附赠2×Taq MasterMix ，2×Fast Taq MasterMix(快速PCR系统)，及DNA Ladder 2000 Plus，满足您的PCR鉴定、电泳实验需求。





质量控制：
· Control Insert克隆后的白色菌落中，有90%以上 含有Insert DNA片段。
· Control Insert经克隆后，经测序确认“T”突出的存在。

除了2×pEC-T vector快速连接预混液,，我公司还供应以下相关产品：



名称：可保种型蓝白T载体
货号：BTN60803
规格：50 ng
本产品是环状的可以制备Clion蓝白T载体的质粒DNA。T载体是克隆PCR扩增产物的必不可少的工具，但是由于市场上的各种T载体质量参差不齐，用户很难购买到满意的产品；同时购买的T载体为线性DNA，不能保种，必须反复购买，累计成本很高。为解决这一问题，我司特推出可保种型T载体，用户只需要购买Xcm I内切酶就可以自己制备高质量的T载体，随用随配，十分方便。

产品特点：
1.一次购买，终身拥有。本产品提供制备T载体用的环形质粒DNA，可以象其他质粒一样保种并长期保存。
2. 随用随配，十分方便。用户只需要提供Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件，就可以自己制备T载体。整个过程只需要两天。
3. T载体含T 率为100%。本方法不是使用传统的加尾法，而是使用Xcm I酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为1.3 Kb的Xcm I DNA片段,经Xcm I酶切后回收得到的质粒DNA(T载体)两端自然全部带有T 突出，比例远远高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T载体。
4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白T载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点，便于后续克隆； Xcm I 位点在Alpha 互补区，可以使用蓝白斑筛选重组子；两边还有T7和SP6 RNA聚合酶启动子，便于制备RNA探针。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

使用方法：

一.细菌的转化
1. 将100μl感受态细胞于冰上解冻。注意：最好使用end A1菌种(如DH1、DH5、DH5?、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考《分子克隆手册》等参考书)。因为这类细菌所含DNase少，制备T载体后，残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。
2. 取5-10μl本产品加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟。
4. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时。
5. 取100μl培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。

二.细菌的鉴定
1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。
2. 按常规的方法进行质粒小量制备。
3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA，如果大规模酶切，需要按比例增加各成分用量:

成分	使用量
Xcm I Buffer,10×	5μl
质粒DNA	<或= 2μg
Xcm I	1μl
超纯水	加到50μl

 37℃保温一小时，65℃保温20分钟使酶失活。
4.电泳，本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。
5. 如果Xcm I酶切图谱正确，则按常规的方法进行细菌的保种。

三. T载体的制备
1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意：一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质(含残留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切质粒。注意：酶切时间最好不要超过一小时，避免残留的DNase对T末端的破坏。
3.电泳后切下含3Kb DNA(既蓝白T载体)的胶段。注意：千万不要用UV照射将要回收的片段，因为UV会使DNA交连，使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奥莱博绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择，最好在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)
4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。
5. 测定T载体DNA的浓度后，将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。

四.连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分：

成分	样品管	阴性对照管
T4 Ligase Buffer，10×	1μl	1μl
蓝白T载体	20-50ng	20-50ng
PCR 纯化产物	50-500ng	不加
T4 Ligase	3-5U	3-5U
补水到	10μl	10μl

注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3:1-10:1。
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作说明书进行连接)。

五.细菌转化和鉴定
1. 取5μl连接产物进行转化，具体步骤见本手册一，最好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。
2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定，可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选，可选用百奥莱博的菌落PCR试剂盒(BTN50901)进行快速筛选，需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。

MCS位点：