AH109酵母感受态细胞北京供应商

特别提示：包括AH109酵母感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：AH109酵母感受态细胞
英文名称：AH109 Chemically Competent Cell
产品货号：MQ0065
产品规格：10×100μl/50×100μl

AH109菌株来源于PJ69-2A酵母菌株，将lacZ报告基因引入PJ69-2A诞生了AH109，此菌株是GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。
Transformation marker为：trp1，leu2，报告基因为：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1。
AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。
质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。
DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。
而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。
正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。
AH109有四个报告基因：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(GAL1，GAL2，MEL1)启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。AH109感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ，gal80Δ,LYS2：：GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
操作说明：
1.取100 μl冰上融化的AH109感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次)10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。
2.将管放42度水浴15min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3.5000 rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。
4.ddH2O 50μl重悬，涂板,29℃培养48-96h。
注意事项：
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y2HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。

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