零背景TA克隆试剂盒(Kan抗性)北京现货

特别提示：包括零背景TA克隆试剂盒(Kan抗性)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：零背景TA克隆试剂盒(Kan抗性)
英文名称：TA Cloning Kit(Resistance to Kanamycin)
产品货号：BTN160686K
产品规格：25次

本产品是基于Topoisomerase能够在几秒钟之内高速连接DNA片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶，连接效率比野生型更高。

产品特点：
1. 高效快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到100%。
2. 适用于具有A尾巴的DNA片段使用。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 转化时只需要37℃10分钟复苏即可涂盘，免去冰浴、热休克和复苏步骤。
5. 零背景，无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal培养基。
6. 本试剂盒按10μl标准反应体系。
7. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择（BTN160686A是含Amp抗性TOPO载体，BTN60686K是含Kan抗性TOPO载体）。

产品组成：

组分	编号	规格
TOPO-Kan载体	BTN160686K	25μl
连接缓冲液	BTN160686B	25μl
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃，有效期一年。

自备试剂：DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）

使用方法：
1. PCR扩增或酶切回收DNA插入片段。如果是PCR制备插入片段，所用引物不能磷酸化，使用Taq系列的DNA聚合酶。
2. 电泳检测并相对定量PCR片段或酶切回收片段（跟DNA marker比较）。并根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的zuì佳用量：

插入片段长度	zuì佳用量
100-1000bp	20-50ng
1000-2000bp	50-100ng
2000-5000bp	100-200ng

3. 在一个干净的塑料离心管中，室温下（不要放在冰上）设置如下连接反应体系：

加入物	加入量
纯化后的PCR产物	不超过8μl
TOPO-Kan载体	1uL
连接缓冲液	1uL
超纯水	补到10uL

  注意：如果使用未经纯化的PCR产物，则需要加入量不能超过1μl，否则PCR体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后，短暂离心，常温（20-30℃）放置0-5分钟。如果在冬天室温低于20℃，建议使用25℃水浴或金属浴。注意：连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化，可以将离心管放-20℃保存。如果转化，则取5μl连接液加到50-100μl刚刚融化的感受态细胞中，轻柔混匀。注意：本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb，则不需要冰浴和热激，直接在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Kan的培养皿上，37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb，则按常规转化方式，先冰浴2-30分钟，然后42℃热激30秒，冰上防放置2分钟，再在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，37℃ 250rpm培养60分钟，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Kan的培养皿上，37℃过夜培养。
8. 用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。

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