第一链cDNA合成试剂盒北京价格

特别提示：包括第一链cDNA合成试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：第一链cDNA合成试剂盒
英文名称：BalbScript 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix
产品货号：JN0002
产品规格：50次|100次

  本试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用M-MuLV反转录酶（JN0011），它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50℃温度.试剂盒中含有重组RNA酶抑制剂（E055），可耐受55℃高温，有效防止RNA降解。试剂盒同时含有Oligo(dT)18，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA，使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板，第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。

试剂盒组成：

组份	JN0002-20次	JN0002-100次
M-MuLV反转录酶（200 U/μl）	25μl	120 μl
RNA酶抑制剂(40 U/μl)	25 μl	120 μl
5xM-MuLV Buffer	150 μl	500 μl
dNTP（10mM）	50 μl	250 μl
Oligo(dT)18（100 μM）	25 μl	120 μl
GAPDH正向引物(10 uM)	20 μl	20 μl
GAPDH反向引物(10 uM)	20 μl	20 μl
Water，nuclease-free	2x1.25 ml	2x1.25 ml

注：2×RT-PCR Reaction Buffer中包含Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、RNase Inhibitor以及反应缓冲液。

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
3、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和běn酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。

实验步骤：
I.第一链cDNA合成
1、融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，离心后置于冰上。
2、按顺序加入下表中的反应物。
3、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。
4、轻轻混匀，离心。
5、如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，42℃孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物，25℃.先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。
6、70℃加热5 min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应或者在-20℃保存少于一周的时间。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。

II.第一链cDNA的PCR扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。

应用实例：

图例一）小鼠胚胎肝脏总RNA抽提。
按百奥莱博RNA抽提试剂盒操作说明书抽提，起始组织量50mg；


图例二）百奥莱博第一链cDNA合成后PCR扩增目的基因。
泳道1：某进口品牌；泳道2：百奥莱博第一链cDNA合成试剂盒扩增结果。（1ug总RNA反转录后，取1ul用于PCR检测，目的基因：GAPDH）

常用反应体系（20μl）

模板RNA	总RNA（0.1 ng～5 μg） poly(A) mRNA（10 pg～0.5 μg） 特异性RNA（0.01 pg～0.5 μg）
引物	Oligo (dT)18引物1μl 随机六聚体引物1 μl 基因特异性引物15～20 pmol
5×Reaction Buffer	4ul
RNA酶抑制剂(20U/ul)	1ul
dNTP(各10mM)	2.0μl
M-MuLV反转录酶（200U/ul）	1μl
ddH2O(Nuclease Free)	至20μl

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