上皮细胞培养套装（thle-3方案交流）

细工生物推荐配方（全部即用现货）：
DMEM/F12        细工生物  货号：12-719F    价格：120元  （美国定制生产，保种体系试剂）
胎牛血清        细工生物  货号：cc-3007.03-25ml  价格：400元 （美国定制生产，保种体系试剂，应用在原代细胞中，代数与状态表现更优）
EGF             细工生物  货号：cc102-100ug  价格：478元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂）
EGF             细工生物  货号：cc102-1ML  价格：2868元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂）
BPE             细工生物  货号：cc023-1ML  价格：352元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂，gibco体系LONZA体系培养基添加后方案更优）
BPE             细工生物  货号：cc023-10ML  价格：2464元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂，gibco体系LONZA体系培养基添加后方案更优）
insulin         细工生物  货号：cc101-5MG  价格：225元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂）
insulin         细工生物  货号：cc101-50MG  价格：975元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂）
hydrocortisone  细工生物  货号：cc103-1ml  价格：47元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂）
Amphotericin B  细工生物  货号： CC002-3    价格：300元(推荐为原代细胞培养开发，与常规两性霉素B不同处是，水溶级别（目前市场常用是DMSO溶，原料成本相差几十倍，效果更优）
以上成套按最小规格报价
推荐：
增强型贴壁试剂   细工生物  货号：CAT:C028    价格：300元(推荐为原代细胞培养开发，原代案例，心肌细胞，神经元，胶质细胞）

Optimized Trypsin细工生物  货号：cat:cc17.3  价格：150元（多家品牌，常年筛选统计后推荐，保种体系试剂，原代细胞，适合半悬半贴细胞）
注：低浓度胰酶是我司一直推荐浓度，随费时，后续细胞状态更优，减少机械力，胰酶化学作用消化可解决细胞成团，团聚等问题，少量黑点一般是吹打力过度，损伤细胞破碎后碎片引起，注意这步，黑点明显会消失，成片黑点，建议换血清与培养基体系）

thle-3（atcc-crl-11233）细胞系是由原代正常肝细胞经sv40大t抗原感染而获得--案例分析及建议

THLE-3细胞几点建议您参考。

消化：不要有机械力 化学作用让细胞消化散  我们统计胰酶只有少数能达到这个要求 这点不知是否有注意到  我们的OPTI胰酶符合这个要求

分析配方建议是：3170+fbs我们在其他几株原代上皮有应用确实能解决问题 ATCC列出这个配方说明他们也存在很难的增殖情况才加血清方案解决

关于贴壁：我们意见是这只细胞也是像293T一样转染的大T抗原 这只也有贴壁不牢的问题 更为严重  所以用很多铺板试剂 类似案例我们解决过LMH细胞

这只要用明胶 我们替换其他方案解决的，ATCC这个铺板试剂与程序及不稳定，我们建议用我们增强贴壁试剂试试。（如非要按ATCC说明做，我们建议都用GIBCO的）ATCC方案也是较繁琐，建议用我们增强贴壁试剂替换（还无案例）

因子：关于上皮细胞添加我们意见是BPE its 不了解成份作用的老师一定要慎重加减，推荐理由是其他几株上皮我们统计有这几个因子都有方案用过。
专利来源 -这些添加因子 符合我跟您说牛脑垂体添加 氢化可的松等添加在以下文段都有说明。
Cell proliferation is measured in a variety of the experiments described below. Thus, the methods used for such measurement are setforth as general methods. DNA synthesis is measured in cells inoculated at clonal density (100 cells/cm.sup.2). The medium is changed to fresh medium the next day and after two additional days of incubation [.sup.3 H]-thymidine (New England Nuclear) is added to the cell cultures at 0.5 .mu.Ci/ml. Twenty-four hours later the acid precipitable fraction is collected on glass fiber filters and the  amount of [.sup.3 H] incorporated is quantified by scintillation counting. Alternatively, proliferation is measured by counting the  number of cells in each colony. Medium is changed to the medium in which proliferation is to be assayed one day following inoculation  at clonal density and the dishes are incubated for a further 7 days. The cells are then formalin fixed and stained with crystal  violet. The number of cells per colony is determined and the population doublings per day is calculated as previously described (13)


血清质量相关推荐：种子库长期评测统计


半量换液-理由来源如下两点
一：专利介绍   -通过查专利要求以下段，符合我跟您说的半量换液
Harris CC, et al. Human liver epithelial cells. US Patent 5,759,765 dated Jun 2 1998   --专利名称
2) culturing one-half of cells of step (1) in a medium containing said compound to be evaluated;
3) culturing the remainder of the cells of step (1) in a medium lacking said compound to be evaluated;
二：ATCC crl11233 介绍
The cells express cytokeratin 18 and albumin in early passage, whereas higher-passage cells in logarithmic-phase growth also express  ytokeratin 19.Ref     -ATCC crl11233 介绍
欢迎技术交流，该类细胞培养问题常年统计。（组织保存，消化，培养）


国内细胞状态统计一些小建议-血清
高质量的血清：应该是细胞出现问题能解决问题，并能持续保证质量一贯性。
与很多老师意见：其他细胞都能养活，就这个细胞养不好。正好相反，建议评审条件正好相反。如能长期关注这种问题，筛选出的血清质量结果也是最可靠的，就像我们出现问题能想到的那款血清，为啥这款血清能够完成几乎所有问题解决，几十年质量一致性，批间差几乎为零。这种血清才是高质量血清。
欢迎与常年从事细胞质量要求高的实验室一起解决各种问题，目前技术、试剂、设计、方法已相对成熟。国内从从细胞建系开始的技术试验已经非常成熟了，我司目前目前跟踪统计的原代细胞建系思路设计及实验已经有几年了，真正的成熟还要做很多的工作。我司十年的基础实践统计，欢迎您的参与与提携。

进展20210917：原代建系要求技术全面性，
用国内库建的细胞系在建系，先摸条件相对容易，成功率会大很多，统计跟踪过几个用户统计跟踪过，养十几代没问题（有几个新手也能养不少代）离体后处理这步也挺难的，肝上皮建系我们一直在统计，ATCC那几个成熟系在国内养的不是很好，统计很多年了，看了部分介绍，其他几个正常组织细胞系养的也不是很顺利，几点关键问题可讨论，密度抑制，贴壁不牢，容易成团，保种不成功，是传代几个较关键问题，离体处理，消化，冻存，这几部用的试剂手法，我们一直在优化，有机会寄试用可比较

二倍体跟原代类似，最好把问题及上下操作步骤列下，我回复下，不然说的较多，不知你需要的那个重点，或者问题重点。沟通前建议都是较好的试剂耗材，不然沟通不准确

例如培养基相关，DMEM-F12很特殊协和库老师很多年前给的参考是现用现配比成品好用，测试统计十几年，还是弄不出进口厂家一样的培养基，这个是我们今年解决的重点。
例如转染相关免疫悬浮类（原代类）难点，转染，容易成团，保种难，对试剂手法都很挑剔，
我们有试剂，手法，和理由都可说明后，您在上实验比较，细胞状态取好方向，最能说明问题。


20211101：统计巨噬相关培养建系，分布在各组织中巨噬也被称为类上皮，通过统计学习到，国外研究在畜牧行业已经非常成熟了。希望与各位高手请教提携合作。我们在基础培养上有些优势，希望合作国内巨噬建系相关合作。国内各细胞库建系经验也不比国外差了。
20231220：基于DMSO优化后，针对二倍体系，原代，类器官单细胞冻存（球体冻存难度大），免疫类细胞原代，系优化，PBMC等，目的提高常年后液氮冻存种子活率。

20230116细胞中问题痛点参考，养原代有积极意义。
系问题关于黑点，系生长慢参考

问题关于黑点
细工建议参考，用对试剂耗材（种子库级别细胞不建议用便宜试剂，保种上百只种子细胞，也用不了多少钱的）胰酶轻柔处理（避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数），几代或十几代后，黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议，经历过黑点的细胞，建议重新保种国内正规库来源细胞。
系生长慢参考
    细工建议参考 给出方案是进口瓶培养（康宁，nunc,德国产细工全部现货） ，种子库级别试剂（三千以上胎牛，我司验证五年以上南美）我司培养基或者是GIBCO培养基，放足培养基（多些也没关系）几天不动，看下恢复情况，结合我司胰酶（无损消化）传几代应该能找回较好状态，该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况（上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况，该因素原因很多，具体情况集体分析）该方法也建议原代首代培养（类器官）就是普通培养基加胎牛（因子贵，lag phase长、无血清不稳点）全部能替代，细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低（不加辅助条件成球）及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。邮件联系
上述思路解决要顺利，来信告知，目前统计进口试剂耗材成功案例，有细胞生长慢，黑点案例都误认为是支原体，合作实验室比较熟悉培养体系，应用后，任何问题都没有，就是复苏初期老师比较心急，没按正常传代后，皿居多，三天以上后，pH变化较快，影响了后面生长。如验证，到任何问题难点都可来信讨论。如有理想趋势生长，胰酶建议用0.05或者我司胰酶（上皮类成片解决要柔和，常规0.25浓度容易消化成细胞泥，膜损伤厉害，对细胞损伤很大，影响救助）

上述适合以下问题备份组 我们会统计更多难点应用有
成瘤不理想细胞株
耐药株复苏救助
细胞养几代后就爬爬这种情况
该理由来自类器官培养统计，及下面各类难养株常年统计，下面内容有需要的可来信告知。我发您，要有针对的痛点难点，我们会补充更多资料。
救助细胞系建议来源国内正规库，公司来源差很多。如照顾我司生意长期订购试剂，我们可送国内库同类细胞株做奖励，我司今年试剂所有原料都是临床原料级别。能到种子库级别。

如验证顺利，细节图片及细节能否发在丁香园这个链接里，我们统计内容也为更好服务每一位用户少走弯路。我们还有相应的奖励。
https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/20665506?replyId=26300800
【原创】共同探讨完成国内细胞统计

20240604
成瘤不稳定文献补充
当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce，1964)，这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。
以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007;Piccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal，2014)。
北医白凡，生物物理所-李翀老师，10-1000个细胞成瘤五六年前文献可查下,需文献可来信告知。
文献参考
017-2015-CSC-lncTCF7
024-2016-Cancer Res-GALNT1


原代建系更新参考 组织-细胞要点

1：离体处理，建议手术刀并排两三个固定后，冰上最快速度处理，建议十分钟内入皿。
2：不管哪种培养体系，都要有一组含血清，这个每个实验室都很熟悉，上清前几代留着，后面建系中，细胞受损后救助（冻存复苏，长期培养驯化过程中细胞状态差等救助），类器官，无血清方案两年统计结果给出含血清参考。含血清优势是可行，每个实验室都熟悉相关足够的经验与问题解决，还可先成功，大量细胞拿到，有充足的细胞后，在评测无血清。
3：冻存复苏：建议两指厚面包裹后直接负80后，第二天液氮，有泡沫冻存盒裹在棉花外面效果更好，建议平时冻存复苏评测。较挑剔的有免疫细胞，原代等测试效果比较好，无血清方案，建议新式冻存方法评测比较。
4：建系病毒要点：高滴度。
5：技巧参考：要对细胞镜下形状熟悉（或者先筛选目的细胞有个大概判断后），可不用分离液，流式等前期筛选，单克隆多做些，等大量培养后在做相关检测，避免分离液化学损伤，流式机械损伤而使细胞建系培养不顺利问题。大大提升成功率，上述1-3是组织到细胞，4是难感染细胞痛点，要能理解上述要点，重复实验容易并可行，也是建系简单重复关键。
组织-细胞    细胞-组织   难养细胞系参考统计，上皮，SV40 （原代要熟悉培养特性，正好与难养系长满传代时间一致。）缺氧培养应用优势整理中，缺氧培养优势是成干后，细胞分化控制目的（相关文献建议看成干后动物模型验证）
6：传代培养注意：千万别按细胞系传代习惯，总是拿出来开看细胞（这点尤为重要，关乎成败）建议多放50%完全培养基后，4-7天传代合适，成纤维，内皮，上皮首代消化费劲，建议考虑组织-细胞处理步骤影响的组织活性，例如操作步骤全程冰上，快，（消化液选择不合适，时间过长等因素），树突，kuffer，难消化建系工业用途可来信告知，这类我们可试完成建系难点痛点建系（我们拿技术换口饭吃）

SV40建系培养特点，细工技术储备充足（国内建系做技术储备），如您建系也用SV40,如遇到问题，可讨论。问题结合统计有些共性，也有组织特性，可讨论。
人肾皮质近曲小管上皮细胞；HK-2    人乳腺上皮细胞；MCF-10A     人肺正常上皮细胞BEAS-2B     人肝癌细胞；Hep G2 [HepG2] 上皮样      人胚肾细胞；293 [HEK-293] 上皮样   人脑星形胶质母细胞瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG] 上皮样
后期相关问题统计
维持培养：维持培养验证建系，种子库等重要实验试剂筛选推荐，细工内部应用维持培养，在高产蛋白，培养基血清试剂评测种子库，生产应用做技术评测，外泌体应用，噬斑工业应用都取得了不错的效果。
控制分化：缺氧，成干，维持培养应用后续在统计讨论
离体后开关通路（细工优化胰酶解决这个问题，胰酶经过各种胰酶敏感细胞系长期统计筛选，胰岛胰腺类细胞系），也是离体后首代培养关乎成活关键。

成干验证，减血清，增长速度很有参考意义。更多分化延展。


当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce，1964)，这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。
以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007;Piccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal，2014)。

痛点补充说明
1：离体处理推荐步骤补充，该方案来自成团成片细胞系，原代问题统计，2010年开始。
  统计了从2005年国内湘雅胰岛胰腺原代，2010开始统计胰岛胰腺细胞系（分离成单个容易活，胰泡，组织粘连不容易增殖，传代。解决这类问题，我司配套胰酶消化产品开发来自这些问题，该类同理问题是细胞工厂大面积消化（五年工业应用），所需消化时间长，前后消化细胞要保证一致，膜受损一致（常规0.25浓度胰酶，对膜损伤导致前后细胞质量不一致）每本细胞培养书籍及权威细胞库介绍最常用一句是，细胞变形后马上终止消化，目前各种胰酶原料来源差别也很大，相关评价过几个大厂原料，我们坚持原始原料能做到，超长时间消化，充分消化成团成片，横竖消化一致并细胞膜无损，后面有兴趣老师可讨论上皮类这类问题可验证。
上皮类细胞系SV40建系培养特点、胶质类细胞系、正常组织细胞系
有时间验证益处是，原代首代培养及第一代处理关键因素。难养系常见问题。
常年统计相关推荐：很多问题案例说明首代消化不下来，组织离体处理步骤过于繁琐，时间过长，影响的细胞活性，还建议不用化学成份，机械力干扰，（淋巴细胞分离液类，流式）细胞活性会更高，加普通培养基加含血清方案，保守的说传十代不成问题，胚胎类来源，精准手法，四十几代没问题。
混杂细胞培养在一起，后面详细介绍简单易行，单克隆几十个或上百个各类目的细胞，成纤维，上皮特性。离体生长顺利培养无BUG推荐。后期补充单克隆推荐potocol.
单克隆后稳转株建系，超量加药筛选，传代加药，复苏加药，痛点全部用充足的技术储备提出参考建议及应用案例。后期补充稳转株推荐potocol.
维持培养验证种子库级别试剂优略对建系方案要点说明，统一理念，对方案实施非常关键。后期补充维持培养验证对种子库重要性。
冻存复苏重点，后期补充冻存复苏验证对建系重要性。
后期补充资料有案例问题的都可提前讨论，问题实战最能说明可行性。
我们远景是完全国内建立工程系，理想有说服力的验证方式是五家以上实验室同时验证方案可行性（欢迎各位老师同学老板参与加盟），简单易行重复验证，可通过各类培养中问题讨论，试剂，耗材，培养环境，技术储备等


20240605

细胞培养上清回输可能原因有两种，一是分泌促生长因子；二是释放竞争性信号，刺激细胞增长，这也是细胞太稀不易生长的原因。建议：原代复苏首代救助，转染后死细胞过多等相关救助。
20240612
原代建系（技术储备充足后续做建工程系），目前细工技术储备理论上，无bug方案推广（该方案来自以下问题特点细胞竖向统计）。
国内各地开始，同步验证每个地区五个团队以上，讨论痛点难点可行后同步实验验证，包括各地区生物药创始人，重点室。
各部位从组织到细胞，成纤维，上皮，腺类

涉及统计资料、
二倍体细胞系培养特点总结（成纤维）
乳腺癌、肝癌、免疫悬浮，淋巴瘤、胰岛胰腺、（上皮）
原代痛点难点：离体处理、单克隆、稳转株、耐药株、冻存复苏优化
建系用病毒效价质量标准评价，

涉及其他实验痛点难点：维持培养、高滴度蛋白病毒生产、晶体研究、
SV40 MEF 大T抗原
纯化后蛋白保护、
原代免疫类、原代正常类、胶质类、

常用贴壁试剂：胶原、明胶、多聚类，粘粘蛋白、Matrigel基质胶、
细工开发促贴壁试剂不同处，毒性几乎没有（救助难养株案例五年统计）超长维持培养。

解决易成团成片问题，这类问题影响细胞活率，维持培养、转染效率不高，冻存复苏活率低。种子库细胞活性维持、单克隆反复保重（简易单克隆法有需要来信告知实验室名称），结合最近几年热门研究痛点问题统计：PDX、单细胞、类器官、给出相关问题理论与实战案例参考，理想状态是平时培养过程中的问题验证效果最好，先有案例问题解决，后面应用会更稳妥，并可行、易行
易成团成片常见系统计如下：
神经胶质类系（BV2,A172,U87MG、U251、TJ905、HS 683、H4、GOS-3、C6、原代上皮首代
各类难养系及原代上皮类:原代上皮首代、SV40、大T抗原系，293、HUN7、HEPG2、HEP3B
免疫悬浮类：THP-1，RAW264.7,JURKAT,HuT 78、RAMOS(RA.1)、NTCC721.221\IM-9、SU-DHL-4、KMYF、DCS

腺类原代、细胞系（腺癌、结直肠腺、前列腺、内膜腺、肾上腺、胸腺、胰腺
腺癌
人乳腺癌细胞；
 MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-453、MCF 7B、MDA-MB-157、SK-BR-3、MDA-MB-468、BT-20、MDA-MB-415、MDA-MB-436、MDA-MB-361、HCC1937
人乳腺导管癌细胞；
ZR-75-1、HCC38、ZR-75-30、T47D [T-47D]、BT-549 [BT549]
人乳腺导管瘤细胞；
UACC812、BT-474、MDA-MB-175Ⅶ、MDA-MB-134Ⅵ
人乳腺上皮细胞；MCF-10A、DU4475
人整合SV40基因的乳腺上皮细胞；HBL-100 [HBL100]

人结直肠腺癌细胞；
 Caco-2、HCT-8 [HRT-18]、HT-29、COLO 205、COLO 320DM [COLO320DM]、HCT 116 [HCT116]、LoVo、SW480 [SW 480；SW-480]、SW620 [SW 620；SW-620]、HCT-15 [HCT15]、LS 174T [LS174T]、COLO 201
人结直肠腺癌瘤株；HCT 116 [HCT116]

 人前列腺癌细胞
DU 145 [DU145；DU-145]、LNCaP、Vcap、PC-3、2B4
人前列腺癌细胞
22Rv1、DU 145、 VCaP、PC-3
人前列腺癌高转移细胞株；PC-3M IE8、小鼠前列腺癌细胞；RM-1、人正常前列腺基质永生化细胞WPMY-1、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1

人卵巢腺癌细胞；SK-OV-3、OVCAR-3
    人乳头状卵巢腺癌细胞；Caov-3

人子宫内膜腺癌细胞；
HEC-1-B [HEC-1B；HEC1B]、KLE、Ishikawa、HEC-1-A
人子宫内膜低分化腺癌细胞；EAG3

人肾上腺皮质癌细胞；
SW-13
人十二脂肠腺癌；HuTu-80、人肾细胞腺癌细胞；ACHN、人子宫内膜低分化腺癌细胞；EAG3、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；PC-12 [PC12]
甲状腺
 人甲状腺鳞癌细胞；SW579 [SW 579；SW-579]、人髓样甲状腺肿瘤细胞；TT、人滤泡状甲状腺癌细胞；FTC-133、人低分化甲状腺乳头状癌细胞；B-CPAP
人甲状腺癌细胞（未分化）、8305C、ACT-1、（乳头状）B-CPAP、BHT-101、C643、CAL-62、HTh-7、Hth83、KHM-5M、KMH-2、KTC-1、Ocut-2C、TTA1、ARO、FRO
人甲状腺鳞癌细胞SW579 [SW 579; SW-579]、人髓样甲状腺肿瘤细胞；TT

胸腺：人胸腺激酶缺陷型细胞；143TK-、犬胸腺细胞；cf2Th    中国食品药品检定研究院
肾上腺：SW-13、    人肾上腺皮质腺癌细胞；NCI-H295R    、人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)；KP-N-NS、红色荧光蛋白和萤光素酶标记的SW13-luc2-tdT    、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞；PC-12 [PC12]    、

胰腺
：    人胰腺癌细胞；PANC-1；人胚胎胰腺组织来源细胞；CCC-HPE-2    ；人胰腺腺泡上皮癌；HPAC；人胰腺癌细胞；AsPC-1；人胰腺导管癌细胞；CFPAC-1；人原位胰腺腺癌细胞；BxPC-3    ；人胰腺癌细胞；HS 766T    ；人胰腺癌细胞系；SW 1990
肺腺：    人肺腺癌细胞；Calu-3    、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H157    、人低分化肺腺癌细胞；SK-LU-1、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H1975、人非小细胞肺腺癌细胞；NCI-H2087、人肺腺鳞癌细胞；NCI-H596、人肺腺癌细胞；NCI-H2009

就重点原代培养中常见痛点问题：细工前面已有介绍部份，解决方案讨论黑点，生长慢、成瘤不稳定、离体首代消化不下来、简易单克隆法、稳转株筛选法、冻存复苏，都有充足技术储备。平时培养过程中问题解决欢迎讨论。
前期相关各种难点痛点都可讨论与验证（邮件沟通，注明实验室名称，无血清体系方案标明，验证时间相对长）