细胞培养迁移/侵袭/MTT/转染/流式分选/诱导整体课题实验

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MTT检测法，是一种检测细胞存活和生长增殖的方法。
检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长（或其他波长）处测定其光吸收值，在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
该方法灵敏度高、经济实用，已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模药物筛选、细胞毒性试验以及细胞放射敏感性测定等等。
 

MTT主要有两个用途：（1）药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；（2）细胞增殖及细胞活性测定。

 

MTT方法能简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应，并且其价格低廉，成为日前各实验室检测细胞活性的选方法之一。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值）来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

 

一、MTT 溶液的配制

1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg，250mg或1g。对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20℃。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

2、注意事项：

（1）在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（2）配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

（3）MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用时需小心。

二、MTT甲瓒溶解液

1、二甲基亚砜DMSO：可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

2、三联溶解液：SDS10g，异丁chun5ml，10M HCl 0.1ml，用双蒸水溶解配成100ml溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。