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文献和实验头一次自己培养L929细胞，手忙脚乱的，把冷冻的细胞直接放进培养基里就结束了。过了60个小时，去显微镜下看，只能看到几个帖壁细胞。仔细想想做实验的步骤，又上网查查帖子，觉得可能是没有在第二天换新培养基的问题，导致冷冻液里的DMSO影响细胞贴壁。不知道培养皿里的细胞还有没有活下去的可能。总之第一次做实验结果不好也不应该轻易放弃。 把培养皿里的上清液转移到离心管里，离心，加入新的培养基重新放到培养箱里培养，原来的培养皿除掉上清液后直接加入新的培养基，因为里面
拿到一株"敲除细胞株"，怎么判断它是不是真的合格？很多人在这一步只做一次 Western，看到条带变浅就认为成功了，等到投稿时才发现问题。 先说结论：验收要分四层——基因型（扩增子 NGS 确认双等位移码、无野生型 reads）、转录本（RT-qPCR 确认 mRNA 下降且排除 NMD 逃逸）、蛋白（Western 确认完全缺失、注意表位与半衰期）、功能（表型实验在两个独立克隆上重现）。此外还要检查细胞株的基础质量（支原体、身份鉴定、代次）。四层只做其中一层，都可能漏掉严重问题
问：复苏后的L929培养第三天出现如图所示的情况，细胞形态不好，而且看上去细胞底层有层模糊的东西，电镜下观察有成块的黑点出现。是什么原因呢？另：培养液偏碱。 答：细胞看上去处于亚健康状态： 1、可能由于培养瓶不干净，而造成细胞底层模糊，而造成的污染； 2、成块的黑点出现可能由于刚复苏出来的细胞部分死亡而聚集成的死细胞团； 3、可能由于细胞在冻存时或是复苏时发生了污染，例如培养基的污染，胰酶的污染，传代等操作不当造成的污染；
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