M-MLV反转录酶（RNase H-)

特别提示：包括M-MLV反转录酶（RNase H-)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：M-MLV反转录酶（RNase H-)
英文名称：M-MLV Reverse transcriptase （RNase H-)
产品货号：WH0169
产品规格：10kU

M-MLV是一种没有RNase H活性的RNA依赖的DNA聚合酶。可以催化以RNA或DNA-RNA杂交链为模板的互补DNA的聚合反应。本酶的RNase H结构域经过点突变分子改造，从而实现了该酶RNase H活性的缺失，这种分子改造不但使得本产品与M-MLV野生型相比具有更高的热稳定性，而且还提高了本产品的反转录效率和对长片段cDNA的反转录能力。

产品特点：
·酶活效率高：高效的逆转录酶活性，后续实验兼容性好。
·底物范围广：适用于所有RNA，尤其是具有复杂二级结构的RNA模板。
·反转片段长：cDNA第一链合成可以达12.3 kb。

适用范围：
1．在二代测序（NGS）应用中，用于RNASeq文库构建过程中cDNA第一链的合成；
2．全长cDNA第一链合成
3．cDNA文库的构建；
4．一步法RT-PCR；
5．RACE分析。

产品来源：
重组E.coli菌株,含有从莫洛尼氏鼠中克隆的改良后的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶基因，基因已通过点突变使RNase H活性缺失。蛋白分子量大小约为：75.9kDa。

产品组成：

组分	规格
M-MLV（200U/μl）	2×25μl
5× M-MLV RT Buffer	2×150μl
100mM DTT	100μl

储存条件：-25℃~-15℃保存，保质期一年。

单位定义：1单位活力定义为在37℃，10分钟内，以polyr（A)/Oligo（dT)作为模板和引物，将1nM dTTP掺入到酸不溶物质所需的酶量。

质量控制：

性质	描述
蛋白纯度	＞99%
酶活性	20,000~28,880 U/mg
单链核酸外切酶活性	2000 U酶中，＜2.0%
双链核酸外切酶活性	2000 U酶中，＜1.0%
双链核酸内切酶活性	2000 U酶中，未检出
宿主基因组污染	2000 U酶中，＜10拷贝
非特异RNAse残留	2000 U酶中，未检出

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行滤除菌处理。
2．RNA样品要避免基因组DNA污染。
3．避免反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4．当使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部，由于酶粘度高，吸取时应慢慢吸取。
5．若后续PCR反应需要扩增的片段较长（>5 kb），则建议用RNase H对cDNA产物进行处理。处理方法为：向反转录产物中（20μl体系）加入1 μl RNase H（5 U/μl），37℃下孵育20min，之后65℃处理10 min进行酶灭活。

使用方法：
1.将模板RNA在冰上解冻；引物、5× M-MLV RT Buffer、dNTPs混合液、100mM DTT和RNase-free ddH2O在室温（15~25℃）条件下解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
2.按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液：

成分	用量
RNA模板	1ng~1μg Total RNA 或1ng~250 ng Poly（A) mRNA
50μM Oligo-dT（15-20)或者 50μM Random Primer或者 10 μM基因特异引物	1~2μl
dNTPs（10mM)	1μl
RNase-free H2O	补充至12μl

3.65℃孵育5 min，然后置于冰上2 min。
4.在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分：

成分	用量
上述反应液	12μl
5×M-MLV RT Buffer	4μl
RNasin（40U/μl）	1μl
M-MLV（200U/μl）	1μl
100mM DTT	2μl

5.如果引物为Random Primer则需将体系现在25℃下孵育10 min；如果引物为Oligo-dT和基因特异性引物则需将体系现在25℃下孵育2 min。
6.42℃孵育60 min。
7.70℃加热15 min终止反应，置于冰上进行后续实验或冷冻保存。如果后续进行PCR反应，则cDNA产物用量不应超过PCR反应体系的1/10。

除了M-MLV反转录酶（RNase H-),，我公司还供应以下相关产品：



名称：T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)
货号：YT513
规格：100U|500U
本酶是一种多聚核苷酸5"羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5"-OH + NTP → 5"-P + NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5"磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应：5"-P + NDP → 5"-OH + NTP(zuì适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3"磷酸基团的单核苷酸的5"磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP也可产生相同的反应：5"-P + NTP + NDP→5"-P + NDP + NTP。T4 Polynucleotide Kinase同时具有3"磷酸酯酶活性，可催化3"磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3"-P → 3"-OH + Pi(zuì适pH为5.9左右)。T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。

产品组份：
T4 Polynucleotide Kinase(10U/μl) ——————100U
Reaction Buffer A(10X)————————————80μl
Reaction Buffer B(10X)————————————40μl
24% PEG Solution———————————————40μl

用途：寡核苷酸、DNA或RNA的5"末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5"端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3"磷酸化的单核苷酸的5"磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3"末端连接；去除3"端磷酸基团。
来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
活性定义：37℃30分钟内，将转移ATP上1 nmol γ-磷酸基团转移到DNA 5"-OH末端所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM 5"-OH DNA，0.05mM ATP，0.1MBq/ml [γ-33P]-ATP。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH7.5)，25mM KCl，0.1mM EDTA，2mM DTT，50% glycerol。
Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应)：500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25℃)，100mM MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA。
Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应)：500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25℃)，0.18M MgCl2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA，1mM ADP。
失活或抑制：75℃加热10分钟可使T4 Polynucleotide Kinase失活，加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。
储存条件：-20℃。

注意事项：
1. 铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。
2. PEG可促进磷酸化反应速率和效率；交换反应体系应加入PEG。

使用说明：
1. DNA 5" 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA—————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)———————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)————20pmol
补充无核酸酶的去离子水 ———————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)——————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在zuì低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚lǜ仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

2. DNA 5’ 末端磷酸化：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer A (10X)——————————2µl
0.1mM ATP—————————————————1µl
补充无核酸酶的去离子水 ——————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)—————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在zuì低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚lǜ仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

3. 通过交换反应(exchange reaction)进行DNA 5" 末端标记：
a. 参考如下表格设置反应体系：
待磷酸化DNA——————————————————1~20pmol (5" 末端)
Reaction Buffer B (10X)————————————2µl
[γ-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol)—————40pmol
24% PEG Solution ———————————————4µl
补充无核酸酶的去离子水 ————————————至19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl)———————1µl
b. 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex在zuì低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 加入1µl 0.5M EDTA (pH8.0)混匀，以终止反应。
e. 后续可以使用酚lǜ仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA，也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(YT009)可以向百奥莱博订购。

4. 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。