NAD激酶(NADK)活性检测试剂盒 微量法

NAD激酶（NADK）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1035
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体5 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	液体10 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂三	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂四	粉剂×1支	-20℃保存
试剂五	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂六	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂七	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂八	液体14 μL×1瓶	2-8℃保存
试剂九	液体20 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂十	液体40 mL×1瓶（自备）	2-8℃保存
标准品	粉剂×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂三：用时加入3 mL双蒸水，充分溶解，可分装保存，-20℃保存两周，禁止反复冻融；临用前取出一支稀释100倍使用。
2. 试剂四：用时加入1 mL双蒸水，充分溶解，2-8℃保存；
3. 试剂五：用时加入2 mL双蒸水，充分溶解，2-8℃保存；
4. 试剂六：用时加入2 mL双蒸水，充分溶解，2-8℃保存；
5. 试剂七：用时加入2 mL双蒸水，充分溶解，2-8℃避光保存；
6. 试剂八：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入0.986 mL蒸馏水充分溶解，可分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
7. 试剂十：自备95%乙醇；
8. 标准品：加入1.9 mL蒸馏水，即得2 μmol/mL NADP标品。临用前稀释100倍得20 nmol/mL NADP标准溶液备用。

产品说明：
NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内唯一能够催化NAD⁺磷酸化生成NADP⁺的酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚 磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡上具有重要作用。

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH；NADPH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT），通过其在570nm的吸光值大小可反映出NADK活性的大小。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
注意事项：

1. 样本的处理必须在0℃-4℃中操作完成，以防止酶变性失活。建议在正式实验前，选取差别较大的两个样本进行预实验。
2. 试剂三、四、五、六、七、八在测定过程中都必须在冰上放置。
3. 当初始吸光值大于0.4时，建议将样本用PBS稀释后测量。

 

1. 若测量样本数量过多，可以将试剂二、五、六、七按比例配成工作液使用。

实验实例：

1. 取0.1大鼠肾脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释2倍后按照测定步骤操作，使用96孔板测得A测定=0.260，A对照=0.125，计算ΔA测定=A测定-A对照=0.260-0.125=0.135，带入标准曲线y=0.0994x-0.0429，计算x=（0.135+0.0429）/0.0994=1.7897，按样本质量计算酶活得：

NADK（U/g 质量）=0.067×x÷W×稀释倍数= 0.067×1.7897÷0.1×2=2.3982 U/g 质量。

1. 取小鼠血浆稀释2倍直接检测，使用96孔板测得A测定=0.093，A对照=0.076，计算ΔA测定=A测定-A对照=0.093-0.076=0.017，带入标准曲线y=0.0994x-0.0429，计算x=（0.017+0.0429）/0.0994=0.6026，按血浆体积计算酶活得：

NADK（U/mL）=0.067×x×稀释倍数=0.067×0.6026×2=0.0808 U/mL。
参考文献：

1. Pollak N, Niere M, Ziegler M. NAD kinase levels control the NADPH concentration in human cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(46): 33562-33571.

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