单宁酶活性检测试剂盒 微量法

单宁酶活性检测试剂盒说明书

微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC4075
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体120 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	粉剂×2支	2-8℃保存
标准品	粉剂×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1支加入1 mL无水乙醇混匀溶解，用不完的试剂可以2-8℃保存一周；（1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂）
2. 标准品：5 mg没食子酸丙酯。临用前加入1.178 mL无水乙醇充分混匀溶解，配成20 μmol/mL的标准溶液，2-8℃保存两周。

产品说明：
单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至270nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。
2. 标准液的稀释：取5μL 20μmol/mL的标准溶液，加入1995μL提取液，充分混匀，配制成0.05μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积。）
3. 对照管样本处理：吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管，沸水浴5min，冷却至常温待测。
4. 加样表（在1.5mLEP管中分别加入）

试剂名称（μL）	测定管	对照管
提取液	170	170
试剂一	10	10
样本	20	20（已灭活）
混匀，置于40℃水浴锅中准确反应10min，立即沸水浴5min，冰浴冷却至常温。10000rpm，室温离心10min，取上清待测。
上清液	10	10
提取液	190	190
充分混匀后测定270nm处的吸光度，分别记为A测定、A对照，计算ΔA测定=A对照-A测定。另取200μL标准液于微量石英比色皿/96孔UV板中，测定270nm处的吸光度，记为A标准。每个测定管需设一个对照管。标准管只需测1-2次。

注意事项：
如果A测定大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积0.2mL不变，如5μL上清液和195μL提取液（相当于F=200/5=40），计算公式中需改变F和V上清液的数值。
实验实例：

1. 取0.1g玉兰叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A对照管-A测定管=0.6631-0.6258=0.0373，按样本质量计算酶活得：单宁酶（U/g质量）=1000×ΔA÷A标准÷W×F（稀释倍数）=1119 U/g 质量。

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