高通量96孔板质粒快速提取试剂盒（醇沉淀法)

特别提示：包括高通量96孔板质粒快速提取试剂盒（醇沉淀法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高通量96孔板质粒快速提取试剂盒（醇沉淀法)
英文名称：96wells Plasmid Fast Extraction Kit
产品货号：WH0156
产品规格：4×96孔|24×96孔板

本试剂盒通过异bǐng醇沉淀的原理纯化得到质粒DNA。本试剂盒采用本公司特制的96孔过滤板和溶液III能够快速高效的提取到高纯度的质粒DNA。适用于高通量质粒的快速制备，每孔处理1.3ml高拷贝质粒菌液，快速完成96个样本的质粒DNA提取，每孔zuì大产量为10-20μg（产量与质粒拷贝数、细菌状态等因素有关）。使用该试剂盒提取的质粒DNA可用于限制性酶切、测序、文库筛选，连接和转化等分子生物学实验。

产品特点：
·方便简捷：可在2-3小时内完成96个样品的提取。
·配备了独特的BaiRed试剂，可以清晰辨明质粒裂解过程中裂解程度。
·纯度高：可直接用于下游实验。

提取流程：

 

组分	4板	24板
溶液P1	125ml	3×240ml
溶液P2	125ml	3×240ml
溶液III	125ml	3×240ml
洗脱缓冲液TB	60ml	240ml
BaiRed	700μl	4×1ml
RNase A（10mg/ml)	1.25ml	6×1.25ml
半裙边96孔过滤板	4个	24个
96孔深孔板	8个	48个
封口膜	26张	150张
透气膜	5张	25张

储存条件：室温（15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃，2-8℃保存条件下若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。溶液P1加入RNase A后，应置于2-8℃保存，可稳定保存12个月。单独包装的RNase A可在室温保存12个月。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．96孔板细菌培养方法：将含相应抗生素的培养基加入96孔深孔板中，每孔添加1.0-1.3ml培养基且挑取单克隆摇菌，加盖透气膜封板以防污染，在220-280rpm 37℃条件下培养20-24h。
2．溶液P1使用前先加入RNase A （请分批配制，每125 ml P1加入1.25 ml RNase A （10mg/ml），可用于4板提取反应），混匀，置于2-8℃保存。
3．每次使用前取50 ml漂洗液PW并加入200 ml无水乙醇摇匀后使用。
4．使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可置于37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。溶液P2和P3使用后应立即盖紧盖子。
5．所有离心步骤均为室温下进行离心。
6．提取的质粒量与细菌的培养浓度、宿主菌、质粒拷贝数等因素有关。
7．实验前使用平衡液处理吸附板，可以zuì大限度激活硅基质膜，提高得率。
8．用平衡液处理过的吸附板zuì好当天使用，放置时间过长会影响提取效果。

BaiRed使用方法：
BaiRed是一种颜色指示剂，用以指示整个操作的正确性，不影响任何下游实验且对人体无害。为可选试剂，客户根据需求选择是否添加。

使用方法：若选择添加，则在使用之前按BaiRed:P1=1:200进行添加，颠倒混匀至完全匀相。在使用时添加BaiRed的P1溶液为红色；添加P2之后红色完全变为紫色说明充分裂解；再添加P3溶液之后匀相状态为黄色说明中和复性充分。

操作步骤：（离心法)
1．平衡96孔吸附板：将96孔吸附板CP3和96孔深孔板叠放在一起，向吸附板中每孔加入500μl的平衡液BL，3,600 rpm（～2,130×g)离心3 min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。（请使用当天处理过的吸附板）。
2．集菌步骤：向一个新的96孔深孔板中添加1.0-1.3ml摇好的菌液（或者取摇好菌液的96孔板），加盖封口膜，3,600 rpm（～2,130×g)离心10min收集菌体，倒掉培养基，倒扣于吸水纸上除去残留的培养基（如果菌体浓度较低，可以重复集菌一次）。
3．向每孔收集好的细菌培养物中加入250 μl溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A)，加盖封口膜，使用漩涡混合器彻底悬浮菌体。
  注意：若溶液P1添加BaiRed试剂，则此时为红色。
4．揭去封口膜，向96孔深孔板中每孔加入250 μl溶液P2，加盖新的封口膜，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，瞬时离心使封口膜上的水珠落回板中。
  注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，若使用BaiRed试剂，完全混匀时颜色为紫色，若裂解不充分会有部分红色残留。混匀后菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。
5．揭去封口膜，向96孔深孔板中每孔加入350 μl溶液P3，加盖新的封口膜，立即温和地上下翻转6-8次使其充分混匀。
  注意：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。若使用了BaiRed试剂，完全混匀应从紫色变为黄色。
6．将96孔过滤板和一个新的96孔深孔板叠放在一起，取750 μl上步得到的裂解溶液转入对应的96孔过滤板中（过滤板的承载量为750 μl），3,600 rpm（～2,130×g)离心5 min。
7．将过滤液全部转入第1步平衡好的96孔吸附板CP3中（96孔吸附板CP3叠放在收集废液的96孔深孔板上），3,600 rpm（～2,130×g)离心5 min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。
8．可选步骤：向吸附板CP3每孔中加入500μl去蛋白液PD，3,600 rpm（～2,130×g)离心5min，倒掉深孔板中的废液，将吸附板重新放在深孔板上。
  注意：如果宿主菌是end A＋宿主菌（TG1,BL21,HB101,JM系列等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，强烈推荐采用此步。
     如果宿主菌是end A－宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。
9．向96孔吸附板CP3每孔中加入700 μl漂洗液PW （请先检查是否已加入无水乙醇），3,600 rpm（～2,130×g)离心5 min，倒掉收集板中的废液。
10．重复操作步骤9。
11．将96孔吸附板CP3叠放在96孔深孔板上，置于3,600 rpm（～2,130×g)离心10min，目的是将吸附板中残余的漂洗液去除。
  注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
12．将吸附板CP3放入新的96孔深孔板中，使用排枪向96孔CP3吸附膜的中间部位悬空滴加80-100 μl洗脱缓冲液TB或ddH2O（pH≥7.5)，室温放置5-6min，3,600 rpm（～2,130×g)离心10min将质粒溶液收集到收集板中。
  注意：通常100 μl的洗脱液在洗脱后能回收到平均55 μl的DNA产物。为增加核酸的得率，可以适当增加洗脱液的体积（比如采用120 μl洗脱液进行洗脱）。此外，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

操作步骤：（负压法)
1．平衡96孔吸附板CP3：将96孔吸附板CP3放入负压装置中，每孔加入500μl的平衡液BL，开启并调节负压，抽掉吸附板中的溶液。（请使用当天处理过的吸附板）
2．以下步骤同（一）离心法中的第2-5步骤操作方法。
3．接（一）离心法第5步骤之后，将96孔过滤板和第1步平衡好的96孔吸附板CP3叠放后置于负压装备上，过滤板每一个孔需对应吸附板的每一个孔。
  注意：此步操作应按照各种品牌的负压装置要求进行操作。
4．取上步得到的裂解溶液750 μl左右，转入对应的96孔过滤板中（过滤板的承载量为750μl），调节负压抽干溶液。
5．可选步骤：向吸附板CP3每孔中加入500μl去蛋白液PD，调节负压抽干溶液。
  注意：如果宿主菌是end A＋宿主菌（TG1,BL21,HB101,JM系列等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，强烈推荐采用此步。如果宿主菌是end A－宿主菌（DH5α,TOP10等），这步可省略。
6．向96孔吸附板CP3每孔中加700 μl漂洗液PW，调节负压抽干溶液。
7．重复步骤6。
8．使用zuì大负压继续抽10min，以彻底抽干吸附材料中残余的漂洗液。若柱尾仍然含有水珠用吸水纸吸干即可。
9．将吸附板CP3放入一个新的96孔深孔板中，使用排枪向96孔CP3吸附膜的中间部位悬空滴加80-100 μl洗脱缓冲液TB或ddH20（pH≥7.5)，室温放置5-6 min，3,600 rpm（～2,130×g)离心10min将质粒溶液收集到深孔板中。

DNA浓度及纯度检测：
1．DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
2．DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约双链DNA 50 μg/ml、单链DNA40 μg/ml。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9。

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