EnGen™ sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes是 sgRNA 合成试剂盒，能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列，单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。
自然界中，启动S. pyogenes 的 Cas9与 2 种RNA 有关。一种是 crRNA或称CRISPR RNA，
crRNA包含大约 20 个核苷酸，位于PAM （Protospacer Adjacent Motif) NGG 序列的上游，与目标DNA 反义链同源互补。另一种RNA 是 tracrRNA 或称 transactivating crRNA， tracrRNA 的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构能被 Cas9 识别。在实验室实际操作中，将
tracrRNA 和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链指导RNA ( sgRNA) , 并与Cas 9 形成复合体，识别并切割目标DNA。
在EnGen 2X sgRNA Reaction Mix 试剂中，有能被来源于S. pyogenes 的 Cas 9识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列有重叠部分。退火形成互补后由 DNA 聚合酶填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒能子一步反应中完成 dsDNA 的合成及RNA 转录，生成具有功能性的 sgRNA。
1. Jinek, M. et al. (2012) Science 816–821. PubMed ID: 22745249
图一: EnGen sgRNA合成试剂盒，S. pyogenes 工作流程
选择目标序列—设计并订制特异目标链—于一次反应中合成dsDNA和sgRNA – DNA酶处理— sgRNA 纯化和定量RNA
图二： EnGen sgRNA合成试剂盒概况
A. 特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子，大约 20个核苷酸的特异目标序列和与S. pyogenes
Cas9 识别支架序列相互补的包含 14个核苷酸的重叠区域（反应混合液提供）。室温下，将特异目标链（或者EnGen sgRNA 调控序列, S. pyogenes）和 EnGen 2X sgRNA 反应混合液（NTPs, dNTPs,
S. pyogenes Cas9 识别支架序列）以及 EnGen sgRNA 酶混合液（DNA和RNA 聚合酶）添加在一起。
B.在 37°C 下，具有 14 个核苷酸重叠区域的 2 个片段发生了退火。
C . DNA聚合酶从 3’ 尾端开始延长，形成了一个双链DNA模板。
D .RNA 聚合酶识别了双链DNA 和T7 启动子后，发生转录。最终形成的sgRNA 包含目标特异
片段/ crRNA 和tracrRNA。 37°C 下，单管反应 30 分钟就能完成所有的步骤。
图三： EnGen sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes合成的 sgRNA 和对照 sgRNA的举例
RNA在 10% 的TBE-尿素变性条件下跑胶，用SYBR金色染料染色。
概述
EnGen™ sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes是 sgRNA 合成试剂盒，能简单快速合成 sgRNA 。利用试剂盒提供的试剂和使用者自己设计的特异性 DNA 序列，单管反应 30 分钟就能获得大量 sgRNA 。
自然界中，启动S. pyogenes 的 Cas9与 2 种RNA 有关。一种是 crRNA或称CRISPR RNA，
crRNA包含大约 20 个核苷酸，位于PAM （Protospacer Adjacent Motif) NGG 序列的上游，与目标DNA 反义链同源互补。另一种RNA 是 tracrRNA 或称 transactivating crRNA， tracrRNA 的一部分与 crRNA 互补，所形成的互补序列及二级结构能被 Cas9 识别。在实验室实际操作中，将
tracrRNA 和 crRNA 的序列进行整合，形成一条长片段单链指导RNA ( sgRNA) , 并与Cas 9 形成复合体，识别并切割目标DNA。
在EnGen 2X sgRNA Reaction Mix 试剂中，有能被来源于S. pyogenes 的 Cas 9识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列有重叠部分。退火形成互补后由 DNA 聚合酶填充。最终生成用于转录的 dsDNA 模板。本试剂盒能子一步反应中完成 dsDNA 的合成及RNA 转录，生成具有功能性的 sgRNA。
1. Jinek, M. et al. (2012) Science 816–821. PubMed ID: 22745249
图一: EnGen sgRNA合成试剂盒，S. pyogenes 工作流程
选择目标序列—设计并订制特异目标链—于一次反应中合成dsDNA和sgRNA – DNA酶处理— sgRNA 纯化和定量RNA
图二： EnGen sgRNA合成试剂盒概况
A. 特异目标链包含三个部分，分别是 T7 启动子，大约 20个核苷酸的特异目标序列和与S. pyogenes
Cas9 识别支架序列相互补的包含 14个核苷酸的重叠区域（反应混合液提供）。室温下，将特异目标链（或者EnGen sgRNA 调控序列, S. pyogenes）和 EnGen 2X sgRNA 反应混合液（NTPs, dNTPs,
S. pyogenes Cas9 识别支架序列）以及 EnGen sgRNA 酶混合液（DNA和RNA 聚合酶）添加在一起。
B.在 37°C 下，具有 14 个核苷酸重叠区域的 2 个片段发生了退火。
C . DNA聚合酶从 3’ 尾端开始延长，形成了一个双链DNA模板。
D .RNA 聚合酶识别了双链DNA 和T7 启动子后，发生转录。最终形成的sgRNA 包含目标特异
片段/ crRNA 和tracrRNA。 37°C 下，单管反应 30 分钟就能完成所有的步骤。
图三： EnGen sgRNA 合成试剂盒, S. pyogenes合成的 sgRNA 和对照 sgRNA的举例
RNA在 10% 的TBE-尿素变性条件下跑胶，用SYBR金色染料染色。
特性和用途
所需材料（不提供）
靶特异DNA序列
热循环仪/ 37°C金属浴/水浴锅
无核酸酶水
RNA定量需要的设备和试剂
RNA纯化柱子
无RNA酶的枪头、管子
微型离心机
储存温度
-20°C
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