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ATP/ADP检测
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ATP/ADP检测
1.样品制备。对于悬浮细胞，将10μL培养的细胞（10³-10'）转移到白色不透明的96孔板中。
粘附细胞：在白色不透明微孔板中培养10³-104个细胞。在测定时，在加入90μL ATP试剂之前立即除去培养基（见下文）。
2.ATP测定。将测定缓冲液、底物和共底物置于室温。在冰上或4℃下解冻酶。建议进行FreshReconstitution。将未使用的试剂（包括酶）储存在20°C下。
ATP试剂。对于每个96孔，将95μL测定缓冲液与1μL底物、1μL共底物和1μL ATP酶混合。向每个孔中添加90μL ATP试剂，并通过轻敲平板进行混合。1分钟后，读取铝量计上的发光（RLU A）。
3.ADP测定。制备ADP试剂：对于每个96孔，混合5μL dH₂O与1μL ADP酶作用。
在读取ATP（RLU A）的发光后10分钟，再次读取样品（RLU B）的发光。该测量在测量ADP（即残余ATP信号）之前提供背景。
读取RLU B后，立即向每个孔中添加5μL ADP试剂，并通过轻敲板或上下移液进行混合。1分钟后，在光度计上读取发光（RLU C）。
4.ADP/ATP比值的计算。从RLU C中减去RLU B，然后除以RLU A：RLUC-RLUB ADP/ATP比率=RLU A
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文献和实验激酶实验方法。实验需要具备放射性同位素操作资质和相应防护条件。 4. ADP生成检测 激酶反应每转移一个磷酸基团，同时会将ATP转化为ADP，因此可以通过ADP生成量评价激酶活性。 这类发光法很适合酶活梯度、抑制剂筛选和高通量检测。结果反映的是整体激酶反应活性，具体哪一个底物位点发生磷酸化还需要其他方法继续验证。 图4丨Phos-tag SDS-PAGE 分离原理示意图 五、常见结果怎么排查 “无激酶组也有磷酸化信号”现象中，哺乳细胞表达纯化的底物可能已经带有基础磷酸化，亲和
Steady State ATPase Assays Coupled Enzyme System
DDW 10 mM Mg・ATP 30 mM PEP 6 mM NADH (Make fresh in 10 mM Tris-OAc pH 7.5, 4.26 mg/mL = 6 mM) PK/LDH (Sigma #P-0294, PK + LDH
的作用是调控基因表达。例如组蛋白甲基化多导致基因沉默，去甲基化则相反；乙酰化一般是转录激活，去乙酰化则相反。当然，也可在此基础上产生复杂的生物学效应。例如组蛋白去乙酰化酶 HDAC 可影响免疫系统；H3K4me3、H3K9me2 能够调控记忆的形成, 而且 H3K 甲基化与 X 染色体失活、基因组印记和异染色质形成有关；H3 乙酰化通过多种机制调控以来 ATP 的染色质重塑 ，并参与炎症反应；H2A、H2B 泛素化则与 DNA 损害反应有关；而 H3S28 磷酸化与 H3K27 乙酰化可激活转录
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