克隆形成/克隆形成实验/细胞功能检测
摘要:在A549细胞中过表达human Oct-4基因,通过对Oct-4基因过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组克隆形成数量的统计学分析,研究Oct-4对A549细胞群体依赖性和增殖能力的影响。实验结果显示Oct-4基因的表达促进A549细胞的克隆形成能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
关键词:Oct-4,克隆形成,A549
一、实验原理
单个细胞在体外增殖6代以上(时间约1周以上),其后代所形成的细胞群体,称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3 - 1.0mm之间。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数, 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱,用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强; 二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在培养皿中,持续一周以上,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。
二、实验目的
使用Oct-4-EGFP质粒瞬时转染A549细胞。通过观察Oct-4过表达的A549细胞的克隆形成率研究Oct-4基因对细胞增殖的影响。
三、实验步骤
实验共分以下5个主要步骤:
1. 质粒转染细胞:
准备293T细胞,转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(4μg质粒,10μL转染试剂lipofectamine 2000)
2. 制备单细胞混悬液;
转染24h后,将细胞消化,制成细胞悬液,血球计数板计数。
3. 按细胞浓度梯度把细胞均匀接种于细胞培养平板;
铺板,6孔板每孔铺200 -1000个细胞,每组细胞各铺3个复孔。
4. 细胞培养2到3周;
每隔3天换一次新鲜培养基。
5. 观察克隆,染色,计算克隆形成率。
10~14天后,染色液染色。数码相机拍照或者扫描仪扫描,计算克隆形成率。
四、实验结果
图1. 和元过表达Oct-4对293T细胞克隆形成的影响
从左开始依次为293T空细胞组,对照组(过表达EGFP),实验组(过表达Oct-4-EGFP),每组实验均重复3次
图2. 和元过表达Oct-4对293T细胞克隆形成影响的统计分析
**表示p<0.01;***表示p<0.001
结论:从实验结果以及克隆数的统计分析可以发现,293T细胞在过表达Oct-4-GFP后,克隆形成能力均高于空细胞组(p<0.01)以及对照组(p<0.001)。
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