高纯质粒少量提取试剂盒

特别提示：包括高纯质粒少量提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高纯质粒少量提取试剂盒
英文名称：High Purity Plasmid mini Extraction Kit
产品货号：WH0035
产品规格：50次

本试剂盒在离心柱型质粒提取试剂盒基础上，增加了本公司特制的过滤柱CS，可在提取质粒的同时去除痕量蛋白及其它杂质，提取的高纯度质粒DNA可多至70μg，适用于需较大量质粒的动物细胞转染等高精度分子生物学实验。

产品特点：
·高纯度：提取的质粒DNA可直接用于转染等高要求实验。
·快速：步骤少，操作简单，节省时间。
·高 效：可提取菌体85%以上质粒DNA。

质粒得率：

质粒类型	处理量	得率	质粒
高拷贝质粒	5-15ml	15-70μg	pTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷贝质粒	5-15ml	5-25μg	pBR322,pACYC及其衍生载体pSC101 及其衍生载体，SuperCos,pWE15

试剂盒组成：

组分	50T
平衡液BL	30ml
溶液P1	30ml
溶液P2	30ml
溶液P3	40ml
去蛋白液PD	30ml
漂洗液PW	15ml
洗脱缓冲液TB	15ml
RNaseA（10mg/ml)	300μl
过滤柱CS	50个
吸附柱CP4	50个
收集管（2ml)	100个

保存条件：室温（15-25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应先将试剂盒内的溶液在室温中放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min以溶解沉淀。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月。加入RNase A和BaiRed后的溶液P1应置于2-8℃保存，可稳定保存6个月。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1．溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2．使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
3．注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。
4．所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm （~13400×g )。
5．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65-70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
6．实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以zuì大限度激活硅基质膜，提高得率。
7．用平衡液BL处理过的柱子zuì好当天使用，放置时间过长会影响效果。

使用方法：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1．柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
2．取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm （~13400×g )离心1 min，尽量吸除上清。
  注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。
3．向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
  注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4．向离心管中加入500μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
  注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5．向离心管中加入700 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm （~13400×g )离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
  注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6．将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12000rpm（~13400×g )离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。
7．12000rpm （~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
8．向吸附柱CP4中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm （~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
9．向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
  注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
10．重复操作步骤9。
11．将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12000rpm （~13400×g )离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
  注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
12．将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 μl洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12000rpm （~13400×g )离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于100 μl，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g )离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。

质粒DNA浓度及纯度检测：
1．得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD₂₆₀值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。
2．OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

除了高纯质粒少量提取试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：白细胞裂解液
货号：BTN130989
规格：250mL
本品为即用型白细胞裂解溶液，可以用于裂解分离纯化好的血液白细胞，用于DNA提取、RNA提取等后续实验。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：(以DNA提取为例)
1. 取新鲜抗凝血5mL，在10mL或15mL的塑料离心管中用红细胞裂解液裂解红细胞(红细胞裂解液有几种配方，用户需要根据所选产品的使用手册进行操作，这里不列出每种的详细步骤)，也可以直接2500rpm离心5分钟后取白细胞层到一新的10mL或15mL的塑料离心管中。
2.在所得的白细胞沉淀中或所得白细胞层溶液中加自备的生理盐水使得白细胞的终体积为2mL。
3. 加1mL的本产品，混匀后55℃ 保温3小时，其间轻轻振摇数次。
4. 加入3mL自备的Tris饱和酚，轻轻震摇5分钟，使得水相和酚相充分分开。
5. 3500rpm离心15分钟，上层水相含DNA，中间白色层为蛋白质，下层为酚相。
6. 将非常粘稠的含DNA的上清液转移到一干净的10mL或15mL的塑料离心管中。
7. 再用Tris饱和酚重复上面的抽提步骤，直到离心后中间层没有白色的蛋白出现为止。
8.在上清液中加入等体积的自备的lǜ仿，轻轻震摇5分钟，3500rpm离心5分钟，转移上清液到一干净的10mL或15mL的塑料离心管中。此步可以除去残留的酚。
9.在上清液中加入0.1倍体积的自备的3 M 乙酸钠溶液(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀，将出现絮状的DNA沉淀。
10. 用移液枪头将DNA沉淀挑取出来，转移到1.5mL的塑料离心管中，用75%的乙醇浸泡2次。此操作可以去除DNA中残留的盐离子。
11.转移DNA沉淀到一个1.5mL的塑料离心管中，空气中放置10分钟左右待乙醇挥发后，加入0.5mL自备的TE缓冲液溶解DNA，4℃放置待用。

名称：新型植物基因组DNA提取试剂盒
货号：WE0174
规格：50次|200次
  本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，适合从各种不同的植物新鲜或冻存组织中提取基因组DNA，并可zuì大限度地去除植物组织中的杂质。本试剂盒无需使用酚/lǜ仿抽提，操作安全。提取的基因组DNA片段大、纯度高、质量稳定可靠，适用于PCR、荧光定量PCR、分子标记、文库构建等实验。

试剂盒组成：

组份	50次	200次
Buffer LP1	25ml	100ml
Buffer LP2	10ml	40ml
Buffer LP3(浓缩液)	21ml	84ml
Buffer GW2(浓缩液)	15ml	75ml
Buffer GE	15ml	60ml
RNase A(10 mg/ml)	300μl	1.25ml
吸附柱DM及收集管	50套	200套

自备试剂：无水乙醇

实验前准备及重要注意事项：
1、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。
2、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer LP3和Buffer GW2中加入无水乙醇。使用前请检查Buffer LP1和Buffer LP2是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer LP1和Buffer LP2于56℃水浴重新溶解。

操作步骤：
1、取植物新鲜组织100 mg左右或干重组织约20 mg，加入液氮充分研磨。
2、将研磨后的粉末收集到离心管(自备)中，加入400μl Buffer LP1和6μl RNase A(10 mg/ml)，涡旋振荡1分钟，室温放置10分钟，使其充分裂解。
注意：
1)使用涡旋振荡或移液器吹打，充分裂解组织，组织裂解不完全会影响zuì终的DNA得率。
2)请勿在使用前将Buffer LP1与RNase A混合。
3、加入130μl Buffer LP2，混匀，涡旋震荡1分钟。
4、12000rpm(~～13400×g)离心5分钟，将上清移至新的离心管(自备)中。
5、加入1.5倍体积的Buffer LP3(使用前检查是否已加入无水乙醇)，充分混匀(如500μl滤液加入750μl Buffer LP3)。
注意：加入Buffer LP3后应立即混匀，可能会产生沉淀但不影响后续实验。
6、将上步所得溶液和沉淀全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如吸附膜呈现绿色，向吸附柱中加入500μl无水乙醇，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、重复步骤7.
9、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。
10、将吸附柱放到一个新离心管(自备)中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
3)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10；若洗脱体积小于100μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少DNA的总产量。如果所得DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE进行洗脱。
4)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

储存条件：室温(15～30℃)。