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- xuanya
- 美国/中国
- XY-TE-0778
- 2025年11月06日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20℃
- 保质期：
两年
- 库存：
900
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体 T3 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有 T3 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 T3 启动子下游开始合成与模板 DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含 T3 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的最佳长度在 20 nt 到 5000 nt 之问。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模板可以合成 2-6 ug RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。
m7G(5´)ppp(5´)G帽结构类似物运输及保存：
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂：如果需要去除转录产物中的 DNA 模板，则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇（均可从本公司另购）
m7G(5´)ppp(5´)G帽结构类似物使用方法
一、制备 DNA 模板
PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T3 启动子。如果模板是 PCR 产物，则可以在设计引物时将 T3 启动子序列（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 T3 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T3 启动子下游。三是需要转录的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如选择了 Pst I 来线性化质粒），则最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此判断纯化的DNA 模板是否有残留 RNase A。
二、体外转录反应
1. 在一个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分：
m7G(5´)ppp(5´)G帽结构类似物注：此为 20uL 反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针，则需要定做 NTP 分开而不是 NTP 预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（本公司有各种加帽修饰核苷酸）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 T3 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3 uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。
注：若需进一步去除 DNA 模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买， 本试剂盒不提供。
1. 在体外转录体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase（ 3-5 U/uL）。
2. 37℃保温 15-30 分钟降解 DNA。
3. 补水到 100 uL（体积太小不方便下步的酚氯仿抽提）。
4. 用等体积（100uL）的 Tris 饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 uL 自备的微量核酸沉淀剂（用前需要摇晃 混匀），振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇，震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃长期保存。
m7G(5´)ppp(5´)G帽结构类似物答客问
1、没有 RNA 产物。最常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模 板 DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor 用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。最常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的第一个和第二个碱 基最好都是 G，在前 14 个碱基内避免有 U 存在。
3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 SP6 RNA 聚合酶的终止序列。 可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。
4、RNA 长度比预计的长。SP6 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依 赖于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。 如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒 DNA 线性化不彻底。
5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转 录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。 如果在转录体系中加入 GMP，则 SP6 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得 RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、如何得到带帽 RNA？需加入带帽 NTP 类似物即可，本公司提供 5 种供选择。
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文献和实验读码框中还有一个ATG。其它一些序列会影响最终得率，如起始密码子前后序列效应， 5`和3`非翻译序列， 5`帽类似物。 ATP位于Kozak翻译起始共有序列的模板[Kozak M(1990)Nucleic Acids Research 18,2828]， 比不含这一共有序列的模板，翻译效率高。在编码区上游含有如EMCVmRNA的内核糖体进入位点，或3`末端含有poly(A)， 可增加翻译效率。加入m7G(5)ppp(5)G类似物会抑制TNT偶联网织红细胞裂解物的翻译，因为这一游离类似物和翻译
条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙 烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过
。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至 100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过
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