CUBIC 组织透明化试剂

CUBIC 组织透明化试剂

具有单细胞分辨率的全脑/全身成像

 

 

CUBIC Trial Kit是一款用于透明化技术CUBIC（Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails and Computational analysis）的试剂盒。 该方法由上田泰己教授和洲崎悦生教授等人开发。 只需将组织浸入试剂盒包含的溶液中，即可对小鼠大脑和全组织、灵长类的 全脑和甲壳类的全组织进行透明化处理和折射率调整。 该方法有望应用于病理学研究和单细胞水平中的观察。     点击此处查看百篇引用和使用CUBIC的文献！

数据提供： 国立研究开发法人理化学研究所上田泰己教授、洲崎悦生教授

 

 

◆CUBIC特点

 

●　操作简单（只需浸入溶液）

●　可透明化整个器官

●　小鼠全脑透明化只需两周

 

 

可进行透明化的组织 

 

小鼠大脑和全组织，灵长类全脑，鱼类、甲壳类、甲虫等的全组织，骨骼（需进行脱钙处理）

 

 

CUBIC Trial Kit试剂盒组成

 

1. ScaleCUBIC-1 Solution——250 mL x 1支

2. ScaleCUBIC-2 Solution——250 mL x 1支

3. Mounting Solution-1——40 mL x 1支

4. Mounting Solution-2——40 mL x 1支

 

 

透明化处理需准备

 

▼ 试剂：

▼ 1. CUBIC Trial Kit

▼ 2. 多/聚甲醛（产品编号：160-16061）

▼ 3. PBS×1（产品编号：164-25511）

 

▼ 实验用具：

▼ 1. 5 mL/15 mL/30 mL/50 mL锥形管（配合样品使用）

▼ 2. 摇床

▼ 3. 用于观察CUBIC透明化样品的荧光显微镜※和推荐物镜^※※

 

※共聚焦显微镜、双光子显微镜、光片显微镜

※※与折射率 (RI=1.49)相匹配的物镜。

※※建议在使用之前咨询显微镜制造商。

 

 

◆CUBIC实验方案事例

 

●　组织透明化实验方案示例（完整器官）

●　组织透明化实验方案示例（2 mm 切片）

●　荧光蛋白表达组织适应实验方案示例

●　免疫组织染色实验方案示例

 

 

▍ 透明化实验方案示例（完整器官）

 

请注意，组织透明化实验方案中所用试剂用量、处理时间需根据样品尺寸进行调整。此外，建议在灌注固定后，取出并重新固定样品。

各个步骤中使用的试剂量约为12-15 mL，清洗时建议使用试剂量的5-10倍。
 

*每2天更换新溶液

**建议以2 : 8、3：7的比例混合 (RI = ～1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用

 

图1．使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠所有器官的案例

 

 

▍ 组织透明化实验方案示例（2 mm 切片）

 

各步骤中使用的试剂量约为2.5 mL，清洗时建议使用试剂量的5-10倍。
 

**建议以2 : 8、3：7的比例混合 (RI = ～1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用。

 

 

图2．使用CUBIC透明化小鼠组织切片的案例

 

 

▍ 荧光蛋白表达组织适应实验方案示例

 

*每2天更换新溶液

**建议以2 : 8、3：7的比例混合 (RI = ～1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用。

***下图数据使用【PI 5 µg/mL in PBS（NaCl 1.5 M），0.05 % NaN₃】

 

图3． CUBIC处理（PI染色）后CAG-EGFP Tg小鼠/完整器官的LSFM成像

 

 

▍ 免疫组织染色实验方案示例

 

脑组织块的免疫染色案例，详细实验方案请见参考文献（1）
 

*每2天更换新溶液

**分别用以下溶液稀释抗体

一抗：0.1% (v/v) Triton X-100, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS

二抗：0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS

***建议以2 : 8、3：7的比例混合 (RI = ～1.49) 试剂盒中的Mouting Solution 1 和 2 使用。

 

 

使用抗体 【一抗】 Goat anti-Copeptin (1: 100) Rabbit anti-VIP (1: 300) 【二抗】 Donkey anti-goat Alexa 546 (1: 750) Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1: 750)

图4．使用CUBIC处理的脑组织块经三维免疫染色后单光子显微镜成像

 

 

◆CUBIC应用案例

 

●　结合病理学方法的应用案例

●　鱼类透明化案例

●　甲壳类（螃蟹、鼠妇）透明化案例

●　甲虫（金龟子、独角仙、锹形虫）透明化案例

●　小鼠全脑血管网络可视化案例

 

 

▍ 结合病理学方法的应用案例

 

　　数据来源于S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017)/已收录
 

图5．使用CUBIC处理各种人器官的切片案例

-经CUBIC处理后可以进行石蜡包埋、切片和HE染色-

 

图6．用共聚焦显微镜观察 CUBIC 处理的人病理组织样品

 

▍ 鱼类透明化案例

 

数据提供：东京海洋大学 海洋生物资源学院 二见邦彦老师

 

图7．使用CUBIC的鱼类透明化案例

实验步骤参见参考文献5）

 

图8．使用CUBIC处理后的鱼类内脏切片案例

-CUBIC处理后，切片5 μm，可用Mayer’s Hematoxylin染色-

 

 

图9．用抗体观察CUBIC处理后斑马鱼鳃的内脏片

 

 

▍ 甲壳类（螃蟹·鼠妇）透明化案例

 

数据提供：浜松医科大学 医学分光应用寄附研究生 绀野在老师，冈崎茂俊老师

 

图10．使用CUBIC的甲壳类透明化案例（上：螃蟹，下：鼠妇）

实验步骤参见参考文献6）

 

 

图11．观察CUBIC处理后（PI染色）的完整甲壳类（左：螃蟹，右：鼠妇）

实验步骤参见参考文献6）

 

 

▍ 甲虫（金龟子、独角仙、锹形虫）透明化案例

 

数据提供：东京大学大学院 理学系研究科生物科学专业 黑田真也老师

甲虫透明化需经过固定、漂白和透明化处理。

详细实验步骤请点击此处查看。

 

图12．CUBIC处理后（PI染色）的甲虫透明化案例（左：金龟子，中：独角仙，右：锹形虫）

图片来源于参考文献7）

 

 

▍ 小鼠全脑血管网络可视化案例

 

数据提供：Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).

 

图 13. 使用胆盐（SDC）透明化小鼠大脑

（上）使用SDS进行去脂透明化，观察到组织肿胀。

（下）使用SDC进行去脂透明化，组织肿胀得到抑制，脑白质也被透明化处理。

实验步骤详见参考文献8）

 

 

图 14. 血管铸型后透明化小鼠大脑皮层

（左）使用SDS进行去脂透明化，在箭头部分观察到血管破裂。

（右）使用SDC进行去脂透明化，几乎未观察到血管破裂。

实验步骤详见参考文献8）

 

注意：

　　列出的产品仅供实验室研究使用，不得用于药物、食品或人体。

 

点击此处查看相关产品：组织透明化配套耗材：成像用透明室
 

产品编号	产品名称	产品规格	产品等级
290-80801	CUBIC Trial Kit CUBIC试剂盒小包装	1 Kit	组织透明化试剂

 

 

组织透明化试剂Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
 

Q：组织透明化的原则

Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配

 

Q：组织透明化的优势

Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可
Ａ：视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。

 

Q：透明化技术的比较

Ａ：下面是水性的透明化技术。

 

 

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化
Ａ：DiI(细胞膜红色荧光探针，一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，
Ａ：SeeDB有着一定优势。另外SeeDB会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经
Ａ：毡）起着一定帮助。

Ａ：SeeDB2是为使用高NA物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY或
Ａ：者CUBIC会是更好的选择。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您应该根据您的物镜的WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过3mm。对
Ａ：于十分薄且脆弱的样品，我们建议使用琼脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重复性。

 

Q：试剂盒成分

Ａ：具体如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2 mm的切片样品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100 mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100 mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100 mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100 mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100 mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100 mL

 

Ａ：2. CUBIC Trial Kit（290-80801）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40 mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40 mL

 

Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50 mL

 

Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5 g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50 mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50 mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50 mL

 

Q：样品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的
Ａ：样品中的荧光信号。

Ａ：CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。

Ａ：SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在
Ａ：1年内观察SeeDB透明化的样品中的荧光信号。

 

Q：抗体的荧光标记

Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。

 

Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：适用于CUBIC的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：适用于SeeDB2的显微镜

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）

 

Q：重构

Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时
Ａ：的表现。重构时也可以使用开源软件。例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。

 

Q：物镜推荐

 

Q：其他物种？其他器官？

Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。

Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0