细胞核/细胞质分离试剂盒

样品实验方案

简要概述

1. 用PBS冲洗细胞
2. 加入500 µL细胞质提取缓冲液
3. 离心20秒
4. 收集上清液（细胞质提取物）
5. 将沉淀重新悬浮在150 µL 1X高盐缓冲液中
6. 离心20分钟
7. 收集上清液（核提取物）

溶液配制

工作溶液配制

1.细胞液提取缓冲液（1X）：将100 µL的10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL的DTT（组分D）添加到0.9 mL的细胞质提取缓冲液（组分A）中。

2.核提取缓冲液（1X）：将100 µL 10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL DTT（组分D）添加到0.9 mL核提取缓冲液（组分B）中。

注意：0.5 mL 1X细胞质提取缓冲液和150 µL 1X核提取缓冲液足以进行1次测定，并根据需要准备新鲜的缓冲液。

实验步骤

1.用冷PBS冲洗细胞1次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入500 µL 1X Cytosol提取缓冲液。 对于贴壁细胞，将贴壁细胞刮入1.5 mL离心管中。

3.剧烈涡旋以完全重悬细胞。

4.以16,000 g离心1-2分钟，然后将上清液（细胞质提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

5.将沉淀重悬于150 µL 1X核提取缓冲液中。

6.剧烈涡旋以完全重悬沉淀。

7.将试管在4°C旋转30分钟。

8.以16,000g离心20分钟，然后将上清液（核提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

图示

图1.使用ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒（AATBioquest®，Cat＃60000）收集Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 A.在有或没有HDAC抑制剂曲古抑菌素A的情况下孵育8ug核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。 B.使用40ug总蛋白的核或细胞质提取物。 2 ug / ml兔抗HDAC1抗体用于探测硝酸纤维素膜过夜。 使用了10 ug / ml的iFluor 647山羊抗兔IgG（H + L）（AATBioquest®，Cat#16809）。 该检测通过UVP多光谱成像系统（Biolite）可视化。 M：标记，Nu：核提取物，细胞：细胞质提取物。

图2.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol分离试剂盒收集了Jurkat细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 µg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

图3.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol Fractionation Kit收集了Hela细胞的核和细胞质提取物。

Components

Example protocol

1. Cytosol Extraction Buffer (1X):
Add 100 µL of 10X Protease Inhibitors (Component C) and 1 µL of DTT (Component D) into 0.9 mL of Cytosol Extraction Buffer (Component A).

2. Nuclear Extraction Buffer (1X):
Add 100 µL of 10X Protease Inhibitors (Component C) and 1 µL of DTT (Component D) into 0.9 mL of Nuclear Extraction Buffer (Component B).

Note: 0.5 mL 1X Cytosol Extraction Buffer and 150 µL of 1X Nuclear Extraction Buffer is enough for 1 assay, prepare fresh buffer as needed.

1. Rinse the cells 1 time with cold PBS. For cells in suspension, collect the cells by centrifugation.
   
2. Add 500 µL of 1X Cytosol Extraction Buffer to cells. For adherent cells, scrape the adherent cells into a 1.5 mL centrifuge tube.
   
3. Vortex vigorously to fully re-suspend the cells.
   
4. Centrifuge at 16,000 g for 1 - 2 minutes and transfer the supernatant (Cytoplasmic extract) to another clean tube. Keep the tube on ice for downstream applications or store at -80°C.
   
5. Re-suspend the pellet in 150 µL 1X Nuclear Extraction Buffer.
   
6. Vortex vigorously to fully re-suspend the pellet.
   
7. Rotate the tube at 4°C for 30 minutes.
   
8. Centrifuge at 16,000g for 20 minutes and transfer the supernatant (Nuclear extract) to another clean tube. Keep the tube on ice for downstream applications or store at -80°C.