非洲猪瘟病毒(ASFV)单重荧光PCR检测试剂盒

非洲猪瘟病毒(ASFV)单重荧光PCR检测试剂盒
一、简介：
本试剂盒用一对非洲猪瘟病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对非洲猪瘟的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染动物的病原学诊断。 

二、非洲猪瘟病毒(ASFV)单重荧光PCR检测试剂盒用途：
本试剂盒适用于动物病料、鼻咽拭子、血液等样本中非洲猪瘟病毒的特异检测。适用于非洲猪瘟病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供临床参考。最低检测限：500copies/mL，稳定性：批内及批间差异系数≤3% 。 

三、试剂盒组成：(48T) 
小盒(扩增试剂盒) 

组份	数量	规格
非洲猪瘟病毒荧光qPCR反应液(ASFV-qPCR MIX)	1管	672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX)	1管	48μL/管
阴性对照(NTC)	1管	50μL/管
阳性对照(ASFV-PTC)	1管	50μL/管

大盒(提取试剂盒) 

组份	规格	数量
FD1试剂	15mL/瓶	1瓶
FD2试剂	500μL/管	1管
FD3试剂	15mL/瓶	1瓶
FD4试剂	30mL/瓶	1瓶
FD5试剂	2mL/管	2管
吸附柱及收集管	48套/包	1包

四、非洲猪瘟病毒(ASFV)单重荧光PCR检测试剂盒储存条件及有效期 
小盒于-20℃以下保存，有效期为6个月；大盒室温避光保存，有效期12个月。 

五、荧光PCR仪器适用范围 
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。 

六、样品的采集与DNA提取 
6.1 样品的采集 
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。 
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管中备用。 
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管中备用。 
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无DNA酶污染的离心管中备用。 
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中备用。 
6.2 DNA提取 
请查看配套提取试剂盒说明书 
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。 

七、非洲猪瘟病毒(ASFV)单重荧光PCR检测试剂盒检测步骤 
7.1 试剂的准备 
从试剂盒中取出荧光qPCR反应液(ASFV-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。 
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
ASFV反应液	14μL	N×14μL
酶混合液	1μL	N×1μL
总量	15μL	N×15μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm 离心10s，向设定的N 个PCR 反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(PTC)5μL，10000rpm 瞬时离心10 秒。
向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ASFV-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。 
7.2 qPCR反应条件 
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件: 

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10 min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。 

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定 
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 
8.2 试验成立判定 
(1)阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。 
(2)阳性对照(ASFV-PTC)：均产生扩增曲线。 
(3)以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。 
8.3 结果判定 
(2)在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明ASFV核酸阳性。 
(2)Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明ASFV核酸阴性。 
(3)如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。 
(4)对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行ASFV qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明ASFV核酸阳性；否则判为样本阴性。 

九、注意事项 
(1)初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。 
(2)所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含DNA酶。 
(3)PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。 
(4)样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。 
(5)试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。