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388
- 英文名:
TOP10?Chemically Competent Cell
- 保质期:
长期
- 供应商:
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件:
-80℃
- 规格:
20×100μl/100×100μl
特别提示:包括TOP10化学感受态细胞在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
产品名称:TOP10化学感受态细胞
英文名称:TOP10?Chemically Competent Cell
产品货号:MQ0002
产品规格:20×100μl/100×100μl
TOP10菌株来源于MC1061菌株,是目前实验室zuì常用的感受态细胞之一,基因型与DH10B高度类似(DH10B为galE15型,而TOP10为galU型)。
TOP10生长速度快(比DH5α快,但比Mach1-T1生长速度慢),10小时可见克隆,recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
可用于构建克隆,蓝白斑筛选等实验,具有链霉素抗性。TOP10感受态细胞经特殊工艺制作,经pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg。
保存条件:-80℃
基因型:
F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔM15Δ lacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endA1 nupG
操作说明:
1.TOP10感受态细胞放置冰中融化(或放手心或室温片刻,待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中),加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,冰上静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB),混匀后37℃,200 rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作,将平板放37℃培养至少13h。
注意事项:
1.感受态细胞zuì好在冰上融化。
2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少zuì终用于涂板的菌量。
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文献和实验本月旧帖整理活动专题: T-A克隆技术 大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论 (1)如何筛选合适的宿主菌株 ◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。 ◇ 如进行蓝/白斑筛选,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉(lacZΔΜ15)。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。 ◇ 要表达重组蛋白,可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株,如BL21(DE3)。 ◇ 使用pGEM载体克隆大片段时(>7-8 kb),经转化
法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞:处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子):带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞,用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态,然后与 pUC18质粒共保温,实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性,用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释,在含氨
4℃,14000r/m离心10min。 7.12 弃上清,空气中干燥。 7.13 10μl H2O悬浮细胞。8、转化(要求:4℃预冷) 8.1 冰上融化感受态细胞(感受态细胞的制备见分子克隆啦)Top10f’。 8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中,枪头轻轻吹打混匀。 8.3 冰上孵育30min。 8.4 42℃,45S~50S。 8.5 冰上孵育2min后,加1ml LB。 8.6 37℃,1h,250r/m. 8.7 2500r/m
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