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        酵母质粒抽提方法

        互联网

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        问:想从酵母提取质粒,转化大肠杆菌,按分子克隆的方法,可能都线性化了,转化率为0,请问有什么好的办法?

        答:以下是我的方法,曾提过数百个,好像转化效率还可以,基本上都提出来了。

        个人体会是Lyticase的活性要好,而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧,u see,酵母质粒所以不好提,就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁,再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题,所以破壁一定要充分。其次吗?感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有,如果担心酵母细胞的活性问题,也可以活化一下再提,不过好象我的实验中这项不是问题.......哈哈….

        详细步骤:

        1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中。

        2、每管加10μl的裂解液(Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存),涡流混匀。

        3、37℃,200-250r/m,30-60min。

        4、每管加10 μl 20%SDS,涡流1min。

        5、–20℃冻存过夜。

        6、室温下融解后,涡流混匀。

        7、质粒提取。

          7.1 1.5ml离心管加TE Buf至200μl的(pH7.0)
          7.2 200μl酚,涡流5min后,4℃,14000r/m离心10min。
          7.3 取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中。
          7.4 等体积酚氯仿,涡流5min。
          7.5 4℃,14000r/m离心10min。
          7.6 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿,涡流混匀。
          7.7 4℃,14000r/m离心10min。
          7.8 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中。
          7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95%~100%的乙醇。
          7.10 –70℃,1h。
          7.11 4℃,14000r/m离心10min。
          7.12 弃上清,空气中干燥。
          7.13 10μl H2O悬浮细胞。

        8、转化(要求:4℃预冷)

          8.1 冰上融化感受态细胞(感受态细胞的制备见分子克隆啦)Top10f’。
          8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中,枪头轻轻吹打混匀。
          8.3 冰上孵育30min。
          8.4 42℃,45S~50S。
          8.5 冰上孵育2min后,加1ml LB。
          8.6 37℃,1h,250r/m.
          8.7 2500r/m,5min,RT。
          8.8 弃上清,在剩余的溶液中悬细胞。
          8.9 接种LB/Amp板,37℃,倒置培养24h。
          8.10 挑克隆,过夜培养,常规碱裂解法提质粒

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