钙荧光探针Fluo-4五铵盐

Fluo-4, pentaammonium salt（Fluo-4 五铵盐）是一种经典的、基于 BAPTA 骨架的可见光激发绿色钙离子荧光指示剂。与细胞可渗透的 AM 酯形式不同，五铵盐形式具有细胞膜不可渗透性（Cell-impermeant），通常需要通过物理手段（如显微注射、膜片钳、划痕加载）进入细胞，或直接用于检测细胞外液中的钙离子水平。

• 中文名称：Fluo-4 五铵盐 / 钙离子荧光探针 Fluo-4 五铵盐
• 英文名称：Fluo-4, pentaammonium salt
• 分子式与分子量：C₃₆H₄₅F₂N₇O₁₃，分子量约为 811.71 g/mol
• 外观性状：通常为固体粉末。
• 溶解性：可溶于二甲基亚砜（DMSO）。
• 储存条件：对光和水分敏感，需密封、避光、防潮，通常储存在 -20 °C 的低温环境中（粉末可保存 3 年，溶解后在 -80 °C 可保存 2 年）。

光谱与荧光特性

• 激发与发射波长：在结合钙离子（Ca²⁺）后，其最大激发波长（Ex）约为 494 nm，最大发射波长（Em）约为 506 nm（部分文献记录为 516 nm），呈现明亮的绿色荧光。该光谱特性使其非常适合被 488 nm 的氩离子激光器激发，并可使用 FITC 滤光片进行检测。
• 荧光增强机制：Fluo-4 本身几乎是非荧光性的。当它与钙离子结合后，会发生构象变化，导致其荧光强度急剧增加（通常增强 100 倍以上），且激发和发射峰的位置不发生显著偏移。
• 钙离子结合亲和力：其钙离子解离常数（Kd）约为 335 nM - 345 nM。相较于早期的探针，这一亲和力使其在检测细胞内高瞬时的钙离子浓度（如钙尖峰，Ca²⁺ spikes）时更为实用。
• 结构优势：它是 Fluo-3 的类似物，通过将其结构中的两个氯原子替换为氟原子，使其激发光谱发生蓝移，更匹配 488 nm 激光器，从而获得比 Fluo-3 更高的荧光信号。

主要应用

• 活细胞钙成像与信号传导：通过显微注射、膜片电极或划痕加载（Scrape loading）等物理方式进入细胞后，广泛用于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下，实时监测细胞内游离钙离子浓度的空间动力学变化。
• 流式细胞术（Flow Cytometry）：用于物理加载的细胞样本，在流式细胞仪上快速检测和分选对钙信号有响应的细胞群。
• 高通量药物筛选（HTS）与体外生化分析：由于其水溶性好且响应迅速，也常用于基于细胞的微孔板检测或体外无细胞体系，用于筛选钙通道阻滞剂/激活剂等药物。