ROX Reference Dye（ROX参比染料）

ROX Reference Dye（ROX参比染料，又称ROX被动参比染料）是一种在实时荧光定量PCR（qPCR）或RT-PCR实验中广泛使用的惰性荧光染料。

1. 作用原理与特性

惰性荧光探针：ROX（6-羧基-X-罗丹明）是一种羧基-X-罗丹明类染料。它不参与PCR扩增反应，不与DNA双链、Taq酶或引物探针发生特异性结合，其荧光信号在整个反应过程中保持绝对稳定。

信号归一化校正：其核心作用是作为被动参考（Passive Reference）。仪器通过计算“报告染料信号/ROX信号”的比值（Rn值），消除非PCR扩增引起的背景荧光波动。

消除孔间与仪器误差：ROX能够有效校正因移液体积差异、反应液蒸发、冷凝水滴、孔壁划痕、气泡以及仪器光电倍增管效率差异或电涌等物理因素导致的荧光信号漂移，从而显著提高技术重复的精确度。

2. 荧光特性

激发/发射波长：其激发波长（Ex）约为 570 nm，发射波长（Em）约为 610 nm。

3. 仪器适配与使用浓度

按需添加：并非所有qPCR仪都需要添加ROX。部分新型仪器内置自动校正功能无需添加；而ABI 7300/7500系列、Agilent MX系列等仪器则必须使用ROX进行动态校正，否则可能导致扩增曲线异常（如呈十字形或断裂）。

终浓度选择：不同仪器所需的ROX终浓度不同，主要分为两类：

高浓度（500 nM）：适用于 ABI 7000/7300/7700/7900系列、StepOne系列等12。在50 μL反应体系中通常加入 0.6~1.0 μL。

低浓度（50 nM）：适用于 ABI 7500系列、Stratagene Mx系列、QuantStudio系列等。在50 μL反应体系中通常加入 0.06~0.1 μL。

4. 溶解与配制

母液规格：市售ROX参比染料通常提供 20 μM、25 μM 等不同浓度的水溶液或缓冲液储备液。

稀释建议：由于低浓度机型每个反应仅需加入极微量（如0.1 μL），为保证加样精确度，强烈推荐使用前用无核酸酶水或专用Buffer将ROX储存液进行 10倍稀释，然后再向反应体系中加入 1 μL 稀释液。

5. 储存条件

温度要求：建议在 -20℃ 条件下长期避光保存。短期使用可置于 4℃ 保存。

注意事项：荧光染料均存在光淬灭问题，配制和使用时必须严格避光。建议按单次用量分装，避免反复冻融。