蛋白质在细胞中往往不是独立完成其功能,而是通常与其他蛋白质相互作用形成复合物,从而在特定的时间和空间内完成特定的功能。了解蛋白质间的相互作用,特别是大规模高通量地筛选蛋白质间的相互作用,进而描绘出蛋白间相互作用的网络图谱,对揭示一个蛋白质的功能和最终阐明细胞中各种生命活动的分子机制有无可取代的重要意义。蛋白质片段互补技术(protein complementation assay, PCA)是一种直观、快速地分析在活细胞中蛋白质之间相互作用及定位的新技术。该方法的机理如下:结构完整的蛋白质才能实现其功能;然而,当功能蛋白分割分成了 N 和 C 端两半时,任何一半均不能单独发挥作用, 但若在空间上距离足够近就可以互补恢复原有功能。将 N 和 C 端两个不具有活性的片段分别与目标蛋白连接,如果两个目标蛋白有相互作用,就使得被分割的功能蛋白的两个片段在空间上相互靠近并重新形成有功能活性的蛋白,通过检测活性即可判断目标蛋白是否发生相互作用。本公司根据不同实验的需要,用于 PCA 的功能蛋白有荧光素酶和荧光蛋白等。
1、将待测基因克隆入含功能蛋白 N 端的表达载体构建诱饵质粒 2、将诱饵质粒转化细胞,选择被转化的细胞 3、再将文库质粒(含 18,000 个人类基因,已克隆入含功能蛋白 C 端的表达载体)转化到表达诱饵质粒的细胞中 4、通过流式细胞仪或荧光素酶报告系统高通量筛选和鉴定与诱饵相互作用的蛋白 5、生物信息学分析结果,给出与诱饵蛋白相互作用的蛋白列表 6、提交实验报告(包括实验操作流程,数据、图表),提交与诱饵蛋白相互作用的蛋白列表 7、通过两两之间相互作用的 PCA 或细胞免疫荧光或免疫共沉淀进一步验证与诱饵相互作用的蛋白(可选)
应用实例:
使用此方法目前发表论文:
1. Chen Y, et al. (2015) Human cells lacking coilin and Cajal bodies are proficient in telomerase assembly, trafficking and telomere maintenance. Nucleic acids research 43(1):385-395. 2. Han X, et al. (2013) Akt regulates TPP1 homodimerization and telomere protection. Aging cell 12(6):1091-1099. 3. Feng X, et al. (2013) The telomere-associated homeobox-containing protein TAH1/HMBOX1 participates in telomere maintenance in ALT cells. Journal of cell science 126(Pt 17):3982-3989. 4. Zheng ZY, et al. (2012) CHMP6 and VPS4A mediate the recycling of Ras to the plasma membrane to promote growth factor signaling. Oncogene 31(43):4630-4638. 5. Lee OH, et al. (2011) Genome-wide YFP fluorescence complementation screen identifies new regulators for telomere signaling in human cells. Molecular & cellular proteomics : MCP 10(2):M110 001628. 6. Wu W, et al (2009) CARD9 facilitates microbe-elicited production of reactive oxygen species by regulating the LyGDI-Rac1 complex. Nature immunology 10(11):1208-1214. 7. Wang Z, et al. (2009) Presynaptic and postsynaptic interaction of the amyloid precursor protein promotes peripheral and central synaptogenesis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 29(35):10788-10801. 8. Kim H, et al. (2009) TRF2 functions as a protein hub and regulates telomere maintenance by recognizing specific peptide motifs. Nature structural & molecular biology 16(4):372-379. 9. Liang J, et al. (2008) Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nature cell biology 10(6):731-739. 10. Chen LY, Liu D, & Songyang Z (2007) Telomere maintenance through spatial control of telomeric proteins. Molecular and cellular biology 27(16):5898-5909. 11. Ding Z, et al. (2006) A retrovirus-based protein complementation assay screen reveals functional AKT1-binding partners. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(41):15014-15019.……