荧光定量PCR MasterMix(SYBR Green)

特别提示：包括荧光定量PCR MasterMix(SYBR Green)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：荧光定量PCR MasterMix(SYBR Green)
英文名称：2×SYBR Green qPCR MasterMix
产品货号：MT0017
产品规格：1ml|1ml×5|100ml

本品是采用SYBR Green 嵌合荧光法进行 Real-Time PCR的专用试剂, 将化学修饰的热启动Taq DNA 聚合酶、反应Buffer、dNTP、SYBR Green染料等试剂预混在一起，是一种2X浓度的单组分预混试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单，只需加入引物、模板、水即可。

2×SYBR Green qPCR Mix中的DNA聚合酶为化学法修饰的Hot Start Taq DNA 聚合酶，该酶在50℃以下100%无活性，只有95℃条件下加热15分钟后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性PCR扩增，极大的提高了PCR扩增特异性。该试剂盒独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。

本品配有单独的ROX内参染料，使得该试剂可应用于所有RealTime PCR 机型，包括：ABI 7000/7700/7900HT, 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)；LightCycler（Roche Diagnostics) ；Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad&MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。


图：A-C为使用SYBR Green法检测 10～107copy模板的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。D.重复性高，误差<±0.5Ct。

特点：
1．热启动酶采用化学修饰，100%热启动
2．单组份预混液，使用方便快捷
3．高特异性，有效抑制非特异性扩增
4．高灵敏度，可检测低丰度基因
5．适用于所有实时定量PCR仪器

产品组成：

包装	2×SYBR Green qPCR Mix	50×ROX Reference Dye
100T×20μl(MT0017A)	1ml	200μl
500T×20μl(MT0017B)	1ml×5	200μl
10000T×20μl（MT0017C	100ml	4ml

储存：请避光置于-20℃或-70℃可保存3年。 注：长期-20℃保存可能会出现沉淀，室温融化后混合均匀，不影响试剂性能。

注意事项：
1．2×SYBR Green qPCR Mix于-20℃保存时容易形成沉淀，可用手轻握或室温放置一段时间后，颠倒混匀待其完全融解后使用。
2．本制品请避光保存(短期6个月内使用可置于4℃)，使用频率低时置于-20℃，反复冻融会使制品性能下降。
3．配制反应液时，注意避免强光照射，并于冰上操作。

使用方法：

1．根据PCR仪选择步骤A或B

A：需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4~0.8μl	0.2~0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4~0.8μl	0.2~0.4μM
DNA 模板	0.5~2μl
ddH2O	Up to 20μl

B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4~0.8μl	0.2~0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4~0.8μl	0.2~0.4μM
DNA 模板	0.5~2μl
ddH2O	Up to 20μl

2．进行 Real-Time PCR 反应,通常采用两步法，程序如下：

Stage 1:	95℃	15分钟*
Stage 2:	95℃	10s
	60℃	30s	35~40 cycles
Stage 3:	Dissociation analysis

注意：由于该酶为化学修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶，必须于 95℃加热15分钟 才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短时间。

3．反应结束后确认 Real-Time PCR的扩增曲线、融解曲线和标准曲线。

除了荧光定量PCR MasterMix(SYBR Green),，我公司还供应以下相关产品：



名称：通用型RT-LAMP恒温扩增试剂盒
货号：BTN101114
规格：50次
本试剂盒可以用于RT-LAMP等温扩增，RT-LAMP即逆转录和Loop-Mediated Isothermal Amplification(环介导等温扩增)的结合，专门用于快速扩增RNA。LAMP是2000年才出现的一种新颖的等温核酸扩增方法。它利用4或6条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下(63℃左右)30－60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于RT-PCR技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。目前已成功应用于人类及动植物、细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的快速检测。

产品特点：
1.高特异性，由于同时使用4-6条特异引物，所以特异性比RT-PCR更高。
2.高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的RNA分子
3. 65℃左右完成RT和LAMP扩增，不需要贵重的热循环仪。
4. 即开即用，包含了除引物和模板RNA外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。
6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。

试剂盒组成：

成分	规格
RT-LAMP Mix(2×)	0.5ml
AMV-Bst混合液	75μl
对照引物混合物	40μl
对照模板	5μl
MgCl2(25mM)	0.2ml
RNase-free水	1ml
说明书	1份

注：RT-LAMP Mix(2×)稀释到1×时，已经有8mM Mg2+，本试剂盒提供的MgCl2(25mM)用于用户优化条件用。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在冰上溶解除酶外的各种组份，混匀，稍离心。在反应管中加入以下组份：

成份	样品管	阴性对照
RT-LAMP Mix(2×)	10μl	10μl
自备FIP引物终浓度	0.8μM	0.8μM
自备BIP引物终浓度	0.8μM	0.8μM
自备F3引物终浓度	0.2μM	0.2μM
自备B3引物终浓度	0.2μM	0.2μM
自备Loop F引物终浓度(可选项)	0.4μM	0.4μM
自备Loop B引物终浓度(可选项)	0.4μM	0.4μM
自备模板 RNA	1-100ng	不加
AMV-Bst 混合液	1.5μl	1.5μl
补水到	20μl	20μl

 注：如在反应管中加入本公司PCR级绿如蓝染料1μL(水则少加1μL)，则可直接在荧光定量PCR仪中进行荧光定量检测。
2. 混匀，置于60-65℃保温30-120分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温120分钟；如果使用Loop引物，则最好保温30分钟。
3. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶。此酶有外切酶活性，所以必须灭活。
4.产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测:
a)琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μL，1-2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱；
b)向扩增产物中直接加入本公司PCR级绿如蓝染料(另售)1μL，混匀，稍离心。将反应管置于紫外透射仪或凝胶成像系统中，紫外灯下可见绿色荧光产生；
c)荧光定量检测。
5. 结果分析：
a)如果没有扩增，则需要用本试剂提供的阳性对照进行扩增。本试剂盒提供阳性对照，反应按下表设置：

成份	阳性对照管
RT-LAMP Mix(2×)	10μl
对照引物混合物	4.0μl
对照模板	1μl
AMV-Bst 混合液	1.5μl
水	3.5μl

 混匀后，置于60℃保温120分钟，其余操作同上。注意：本对照引物中没有Loop引物，所以最好保温120分钟。
b)如果阳性对照能够扩增出，则说明试剂盒没有问题，可能是模板或引物的问题。如果阳性对照没有扩增出条带，则是试剂盒的问题，请跟厂家联系。

注意事项：
1.引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。
2.引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3. 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4.反应中各个引物的浓度及比例对扩增效果有一定的影响。
5. 建议先将所有引物混合在一起，配制成10.浓度以方便使用。
6. LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP(可能导致反应效率下降)、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。
7. 要确证扩增的为目标基因，可以使用特定的限制性酶切和/或Southern杂交。
8. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。