平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术)

特别提示：包括平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术)
英文名称：Zero background flat end fast connection kit(with mcs)
产品货号：ALH339
产品规格：20次|40次

本试剂盒是一种先进的自杀基因阳性选择克隆系统，可以高效克隆平末端PCR产物和任何具有平末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的 DNA片段都有效。 阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过95%的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）扩增的平末端 PCR 产物可直接连入克隆载体。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。

试剂盒提供一个新颖的自杀基因阳性选择克隆载体t。该载体含有致死的自杀基因（内含多克隆位点），当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长；当载体与片段连接不成功，载体自连后自杀基因正确表达，包含自连空载体的细胞无法存活，即“零ZERO”背景。这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选，极大地加速了克隆筛选进程。

为方便酶切作图和插入片段基因操作，本试剂盒克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。此外，该载体含有T7启动子，可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。

试剂盒组份(20次)：
平末端载体(40ng/μl)——————————————20μl
900bp Control（40ng/μl）————————————5μl
2×Quick Ligation Buffer-————————————100μl
T4 DNA ligase（5U/μl）—————————————20μl
Forward Sequencing Primer (10μM)————————50μl
Reverse Sequencing Primer (10μM)————————50μl
注：
forward sequencing primer, 23-mer 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’
reverse sequencing primer, 24-mer 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’

储存条件：-20℃，有效期6个月。

本制品别名：平末端克隆试剂盒

除了平末端载体连接试剂盒（含多克隆位点）(T4连接酶技术),平末端克隆试剂盒，我公司还供应以下相关产品：



名称：cl857 Sam7 λDNA(非甲基化)
货号：BTN90407C
规格：5μg
本产品Lambda DNA(λDNA)为λ噬菌体中的DNA，是一种常见的DNA底物，分子量为31.5×106Da/48502bp，浓度为200～500μg/ml。A型为普通Lambda DNA。B型为不含N6-甲基腺嘌呤Lambda DNA。C型为非甲基化的cl857 Sam7 λDNA，是从感染的大肠杆菌GM119菌株中分离得到的。该菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性。非甲基化的λDNA以作为对DNA甲基化敏感的限制性酶的底物。

储存溶液：Tris-HCl(pH8.0)10mM；EDTA 1mM

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

纯度：
1. OD260nm/280nm＞1.8。
2. 琼脂糖凝胶电泳出现清晰单一条带。
3. 1μg的λDNA在Hind III酶切Buffer中37℃保温16小时后，琼脂糖凝胶电泳时出现清晰单一条带。
4. 1g的λDNA 用Hind III酶切(37℃，2小时)后，在琼脂糖凝胶电泳时出现8条清晰的DNA电泳带。

名称：DH5α化学感受态细胞
货号：MQ0001
规格：20×100μl/100×100μl
DH5α菌株是实验室zuì常用的感受态细胞。缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于蓝、白斑筛选。
DH5α菌株的缺点是生长缓慢，37℃需培 12-14小时才能看见克隆；如需加快试验速度，请选用TG1，Mach1-T1，XL10-Gold等生长速度快的感受态细胞。
DH5α感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率约1×109cfu/μg。
保存条件：-80℃
基因型：F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F)U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+)supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1 phoA
操作说明：
1.DH5α感受态细胞放置冰中融化(或放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中)，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰上静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少17h。
注意事项：
1.感受态细胞zuì好在冰上融化。
2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少zuì终用于涂板的菌量。

名称：Lipofect脂质体转染试剂
货号：GL2118
规格：0.5ml|1ml|5×1ml
用途：
适合于将核酸(DNA和RNA)转染入真核细胞。

注意事项：
无菌溶液，是一种新型的阳离子脂质体转染试剂，具有低细胞毒性；对多种类型的细胞和培养板都具有高转染效率。

储存条件：4℃，12个月

名称：植物电穿孔缓冲液
货号：GL1190
规格：100ml
用途：
植物电穿孔

注意事项：
主要由PBS、甘露糖醇、氯化钙组成。

储存条件：4℃，6个月

名称：DH5α受体菌
货号：QN2147
规格：1ml
本制品是一种用于铺制平板培养质粒和hsd R 17 rec A 1 end A 1gyr A 96 thi - 1 rel A 1粘粒的重组缺陷琥珀抑制型菌株。其中φ80lac Z Δ M15突变可与pUC载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选。

储存条件：-70℃可长期保存，-20℃可保存一年。

名称：零背景快速连接试剂盒（不含MCS)
货号：WH0192
规格：20次
本试剂盒是一种阳性选择克隆系统，可以高效克隆各种PCR产物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。阳性选择载体和插入片段连接仅需5min即可获得超过95%的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu Polymerase）扩增的平末端PCR产物可直接连入克隆载体。由无校正活性的聚合酶（如：Taq Polymerase）或聚合酶混合物扩增的PCR产物在连接前需用试剂盒提供的热稳定DNA平端化酶进行末端平端化（7 min）即可。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。

试剂盒提供一个新颖的即用型阳性选择克隆载体。该载体含有致死基因，克隆位点处插入外源片段会引起基因失活，因此只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落。而自身环化的pLB-simple Vector表达致死毒性蛋白（无外源片段插入），转化后杀死大肠杆菌细胞。这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选，极大地加速了克隆筛选进程。

产品特点：
·高效快速：零背景无需蓝白斑筛选，5min快速连接。
·灵敏广泛：适合低浓度片段和长片段连接，适合平/粘末端连接。
·无多克隆位点：方便客户自行引入酶切位点进行亚克隆。

载体图谱：



试剂盒组成：

组分	规格
Simple Vector（35ng/μl)	20μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	20μl
2×Reaction Solution	100μl
Blunting Enzyme	10μl
Forward Sequencing Primer（10μM)	200μl
Reverse Sequencing Primer（10μM)	200μl
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	10μl
ddH2O	1ml

保存条件：-20℃保存，避免反复冻融。
Forward Sequencing Primer，23-mer：5"-CGACTCACTATAGGGAGAGCGTC-3"
Reverse Sequencing Primer，24-mer：5"-AAGAACATCGCTTTTCGATGGCAG-3"

不同片段使用量：
1．载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:10，对于1kb以下的片段建议使用1:3的比例，1kb以上的片段建议使用1:7的比例。
2．请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度和片段长度来计算其摩尔比。插入片段用量，可根据以下公式粗略计算：
  插入片段用量ng=（3～10)×插入片段长度/载体长度×载体用量ng
  连接体系中35ng的载体，不同大小的PCR产物zuì佳加入量举例如下：

PCR产物长度	zuì佳的使用量
700bp	25ng
2000bp	165ng

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．转化过程中使用对照片段做对照是非常必要的，在实验出现问题时可以确定原因。
2．建议留下部分连接产物，在出现问题后能迅速的补救，减少不必要的重复实验。
3．涂布用量可根据具体实验作相应调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2 min）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。

使用方法（以下的步骤请在无菌条件下操作）
一、平末端连接方法：
  ?用于高保真耐热DNA聚合酶产生的具有平末端的PCR产物的克隆。
  ?若由其他耐热聚合酶产生的粘性末端的PCR产物进行克隆时，请先进行平端化，详见“粘末端连接方法”。
  ?本方法也适用于由限制性内切酶产生的平末端的DNA片段，连接前DNA片段应使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，载体与片段的摩尔比参考“不同片段使用量”的介绍。
1．按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分

成分	使用量
目的PCR片段	X μl
Simple Vector（35ng/μl)	1 μl
2×Reaction Solution	5 μl
T4 DNA Ligase（3U/μl）	1 μl
ddH2O	补足至10 μl

  轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5 sec。
2．将混合反应液放置室温（22℃）反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
  注意：如果插入片段长度大于3 kb，可以将反应时间zuì大延长至30 min。

二、粘性末端连接方法：
  ?用于Taq DNA Polymerase或含有Taq DNA Polymerase的混合酶产生的3′端带A的PCR产物的克隆。
  ?如果PCR产物末端的结构不明确，请使用粘性末端连接方法。
  ?本方法也适用于由限制性内切酶产生的5"或3"带有突出端的DNA片段，连接前DNA片段应使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，载体与片段的摩尔比参考“不同片段使用量”的介绍。
1．按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分，进行平端化反应。

成分	使用量
Insert DNA	X μl
2×Reaction Solution	5 μl
Blunting Enzyme	0.5 μl
ddH2O	补足至8 μl

  轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5 sec。
2．将混合反应液置于20℃反应2 min，然后置于70℃反应5min，放在冰上短暂冷却。
3．向平端化的反应体系中加入下列成分

成分	使用量
Simple Vector （35ng/μl)	1μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	1μl

4．将混合反应液置于室温（22℃）反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。
  注意：如果插入片段长度大于3kb，可以将反应时间zuì大延长至30min。

对照实验：（实验方法同粘性末端连接）
1．按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分，进行平端化反应。

成分	使用量
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	0.5μl
2×Reaction Solution	5μl
Blunting Enzyme	0.5μl
ddH2O	补足至8μl

  轻轻弹动离心管以混匀内容物，短暂离心3-5 sec。
2．将混合反应液置于20℃反应2 min，然后置于70℃反应5min，放在冰上短暂冷却。
3．向平端化的反应体系中加入下列成分

成分	使用量
Simple Vector（35ng/μl)	1μl
T4 DNA Ligase（3U/μl)	1μl

  轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5 sec。
4．将混合反应液置于室温（22℃）反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化反应。

转化
1．制备含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，至少预热20min。
2．转化
a．取部分连接产物加到50～100μl TOP10感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30min（必要时请使用超螺旋质粒pUC19同步转化感受态细胞作为对照检测转化效率，将0.1ng pUC19加入另一只感受态细胞管中，其余的操作步骤与连接产物的转化步骤同步进行）。
b．将离心管置于42℃恒温90sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3min，其间不要摇动离心管。
c．向离心管中加入250～500μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm、37℃振荡培养45min。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
d．将离心管中的菌液混匀，吸取100μl加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16h。

检测
1．常规检测：将得到的菌落接种1-5ml LB（含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素）培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
  Control Insert DNA的PCR鉴定，请参考以下反应条件：

2．快速检测：挑取菌落直接进行PCR检测。
3．测序鉴定：使用常规或快速方法进行初步的鉴定后进行序列的测定。

反应体系：
标准体系为10μl体积，5μl的反应体系也能取得很好的效果，试剂用量减半。