pU6-Decoy哺乳编辑质粒

质粒构建及提取概述

1、质粒的概念 质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A

Cell Rep：上海科技大学季泉江团队开发出高效微型 CRISPR-SpaCas12f1 基因编辑系统

统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。来自 Syntrophomonas palmitatica 的紧凑型 SpaCas12f1 只有 497 个氨基酸，该研究首先系统地表征了 SpaCas12f1 的生化特性及对 DNA 识别与切割的模式，证明了 SpaCas12f1 是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，可在 tracrRNA 和 crRNA 的帮助下有效切割含有 5'-NTTY (Y 代表 C 或 T)PAM 的双链 DNA。此外，SpaCas12f1 拥有与 AsCas12f1 相似的切割模式

CRISPR 实验利器：BTX 电转仪

，从而诱导 CRISPR 结构通过这些空隙进入细胞中。在电脉冲撤离后，细胞恢复原有状态，这种物理学的方式并不影响细胞内部任何代谢及生理变化。BTX 电转和 CRISPR外源物质如何高效的进入目的细胞是进行表达修饰实验（CRISPR、基因编辑、基因工程）成功的关键。BTX 电穿孔系统由于它的易用性、重复性、高效率和低毒性，已经成为将 CRISPR 结构导入细胞（如哺乳动物细胞、细菌、酵母、植物、寄生虫等）的重要手段。使用 BTX 系统可进行多种类型转染；体外培养--贴壁细胞、悬浮细胞及原代细胞·在体·在卵