耐热逆转录酶II

特别提示：包括耐热逆转录酶II在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：耐热逆转录酶II
英文名称：Reverse Transcriptase II
产品货号：SY0294
产品规格：2000U

Reverse Transcriptase（第二代耐热逆转录酶）是Reverse Transcriptase（第一代耐热逆转录）的升级产品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比，进一步大幅提高了热稳定性，50℃下半衰期超过240min，并长时间耐受55℃高温且保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，增加了多个突变位点，进一步增强了模板亲和力和行进性，大幅提升全长cDNA的合成能力，可获得长达20 kb的cDNA。另外，对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

活性定义：以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。

质量控制
核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。
功能检测3：逆转录体系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers为引物，测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

准备工作
1. 防止RNase污染：请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。
2. 引物选择：
2.1 后续实验为PCR
a, 如果模板为真核生物来源，一般情况下首xuǎnOligo dT18，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得zuì高产量的全长cDNA。
b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性zuì高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。
c, Random hexamers特异性zuì低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。
2.2 后续实验为qPCR
a, 将Oligo dT18与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

除了耐热逆转录酶II,，我公司还供应以下相关产品：



名称：LAMP可见光染料
货号：BTN130833
规格：1mL
本产品为20×浓度的LAMP核酸染料，可以直接加入到LAMP或者RT- LAMP反应体系中，随反应进行其颜色发生改变，从而实时监测反应的进程。

产品特点：
1. 实时监测LAMP或者RT-LAMP反应进行，随反应发生其颜色发生改变。如果发生LAMP扩增，颜色由反应前的紫色变成天蓝色。
2. 使用方便，不需要开盖，不需要电泳，直接定性检测LAMP反应是否发生。
3. 灵敏度高，灵敏度跟SYBR Green I相当(但SYBR染料需要UV激发)，本产品的激发光是自然光。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1. 将本产品放置在室温融化，然后震荡10秒钟，短暂离心后待用。
2. 将本染料按LAMP反应体系总体积的1/20加入到LAMP扩增反应液中。
以20μL体系为例：

成分	样品管	阴性对照
LAMP Mix(2×)	10μl	10μl
FIP引物终浓度	0.8μM	0.8μM
BIP引物终浓度	0.8μM	0.8μM
F3引物终浓度	0.2μM	0.2μM
B3引物终浓度	0.2μM	0.2μM
Loop F引物终浓度(可选项)	0.4μM	0.4μM
Loop B引物终浓度(可选项)	0.4μM	0.4μM
MgCl2(25mM)	3μL	3μL
模板DNA	1-100ng	不加
Bst DNA聚合酶(8U/μL)	1.5μl	1.5μl
LAMP可见光染料	1μl	1μl
补水到	20μl	20μl

3. 观察反应液颜色变化，如果发生LAMP扩增，颜色由反应前的紫色变成天蓝色。