快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)

特别提示：包括快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)
英文名称：Fast TaqMan Mixture
产品货号：WE0151
产品规格：1ml|5ml

  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×,包含Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+等，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列检测。本品含有的Fast Taq DNA Polymerase，能有效减少在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活仅需在95℃孵育30s。整个PCR反应过程比普通反应可节省约40分钟，大大缩短了PCR的反应时间。独特的PCR缓冲体系与快速热启动酶的组合，有效抑制了非特异产物的产生，并显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，线性范围更宽。该产品适用范围广，可用于普通和快速定量PCR程序。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0151)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0152)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0153)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

组份	WE0151-5ml	WE0152-5ml	WE0153-5ml
2×Fast TaqMan Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×Fast TaqMan Mixture(With ROX)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)所用探针的终浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序：
建议采用两步法PCR反应程序，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30 s
变性	95℃	5 s	35-40 个循环
退火/延伸	60℃	30 s

注意：
1)本产品所采用的酶须在预变性95℃、30s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行解链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1-4分钟，以使起始模板充分解链。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

除了快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针),，我公司还供应以下相关产品：



名称：硫酸镁溶液(PCR级MgSO4溶液)
货号：BTN130840
规格：5mL
本产品为专门用于PCR的MgSO4溶液，浓度10mM，可以用于调节MgSO4的最佳浓度。MgSO4为常用的PCR增强剂之一。

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

名称：DNA Shuffling试剂盒
货号：BTN131178
规格：10次
DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术，它以一个或多个基因为起始材料，通过先随机断裂成小片段，再进行互为模板和引物的PCR(无外加引物)，最后再进行常规PCR(外加引物)等处理，最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。其原理示意图如下：


产品特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板，无需单独准备各成分。
2.操作手册经过优化，1-2天即可完成，节省大量优化时间。
3.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

试剂盒组成：

成分	规格
PCR Mix 3.0，2×	1.5mL
DNase I溶液(1U/μL)	10μl
溶液A，10×	60μl
溶液B，10×	60μl
超纯水	1mL
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

使用方法：
1.待突变基因片段的制备：待突变基因片段可以用含此基因的质粒为模板、用PCR法或酶切法制备。制备时需保证含此基因(或此基因的一部分)的DNA片段总长度不要超过1kb，同时比DNA shuffling终产物(第二轮PCR产物)长200-400bp。每次DNA Shuffling实验至少需要2μg起始DNA片段(如果含几个基因片段，则彼此的比例为1:1)，并且必须通过胶回收的方法回收，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。最后需用分光光度法准确定量。
2.提前准备37℃和75℃水浴，同时新鲜配制0.1U/μL的DNase工作液放冰上待用(必须在用时才配制，方法是将1μl 本试剂盒提供的1U/μL的DNase I溶液和1μl溶液A和8μl超纯水混合)。此溶液需在24小时内使用。
3.在一个离心管中，按顺序加入下列成分：

成分	用量
待突变基因片段(第1步制备)	2μg
溶液A	5μl
溶液B	5μL
DNase I工作液(第2步制备)	2μL
超纯水	36μL

4.充分轻柔吹打混匀后37℃水浴8分钟，然后立即放75℃水浴处理10分钟以灭活DNase I。
5.在2-3%琼脂糖凝胶上电泳，用常规的胶回收法回收25-150bp范围的所有片段待用。注意：一定要加合适的DNA marker以便确定片段范围，最好使用本公司生产的绿如蓝核酸染料(可见光型)作为电泳染料以避免用UV照射DNA，否则UV使DNA发生的交联将极大降低后续扩增效果。
6.分光光度法精确测定回收片段的浓度。
7.在PCR管中按顺序加入0.5μg上步回收得到的回收片段、50μl 2×PCR Mix、加超纯水到100μl。
8.按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：

过程	温度	时间
PCR前变性	94℃	150s
PCR反应(40循环)	94℃	30s
	47.5℃	45s
	72℃	10s，每次循环后增加5s
PCR后延伸	72℃	10min

9.取5-10μl进行电泳检测，然后进行PCR回收，得到第一轮PCR产物。
10.将回收的第一轮PCR产物1μl原液作为模板设置3管第二轮PCR反应。

成分	用量
回收的第一轮PCR产物	1μL
PCR Mix 3.0，2×	50μL
自备DNA Shuffling引物	各1μM
超纯水	加水到100μL

11.按下列PCR参数进行第二轮PCR。

过程	温度	时间
活化	94℃	150s
PCR反应(25次循环)	94℃	30s
	47.5℃	45s
	72℃	60s，每次循环后增加5s
PCR后延伸	72℃	10min

12.电泳检测，回收预期大小的PCR产物，用于后续的构建克隆文库实验(略)。

疑难解答：
Q：易错PCR和DNA Shuffling有何区别？
A：前者引入的是点突变，后者引入的是重组突变。示意图如下：