TAKARA 高特异性qPCR试剂 RR820A (原SYB

一、产品介绍
本品是采用 TB Green 嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。制品中含有 Real Time PCR反应的最适浓度TB Green，是一种 2X 浓度的 Premix Type 试剂，进行实验时，PCR 反应液的配制十分方便简单。
本品中还添加了Tli RNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以很好地抑制由cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。
本品Buffer经过改良，使反应特异性比TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)（Code No.RR420A/B）更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和Hot Start法用DNA聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行重复性好、可信度高的Real Time PCR解析。

二、试剂盒原理 
本制品使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增，通过检测反应液中TB Green的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。
1．PCR
PCR 法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA 聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了TaKaRa Ex Taq HS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。
2．嵌合荧光检测法 
TB Green与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的TB Green荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，TB Green与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。

 

三、产品性能展示
在小鼠中，暴露于蟑螂过敏原（CRA）为过敏性气道炎症提供了一个模型。在这个实验中，细胞因子白细胞介素4（ IL-4 ）在小鼠接受CRA治疗后的肺组织样本中的表达进行了测量。定量PCR（qPCR）使用 TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行 使用应用生物系统7500实时PCR系统。TB Green Premix Ex Taq II 试剂盒提供了准确的基因表达测量，使相对 IL-4 诱导水平在CRA中的量化。
结核分支杆菌绿色 预混剂 Ex Taq II酶高效特异地扩增小鼠 IL-4 和 GAPDH 控制。 IL-4 的相对表达 在 CRA 处理的肺样本中比 PBS 处理的样本高。

 

IL-4 的相对表达水平 由 qPCR 确定。 IL-4 的 表达倍数 （与 GAPDH 相比）在 PBS 或 CRA 处理的小鼠肺样本中。

 

细胞因子IL-4的上调与过敏症有关。预计IL-4的表达会在CRA诱导的过敏性气道炎症模型中增加。事实上，使用TB Green Premix Ex Taq II，相对增加IL-4基因在小鼠的肺样本中准确检测到，这些小鼠对CRA敏感并受到挑战。TB Green Premix Ex Taq II提供了对基因表达的敏感和准确检测。
TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNase H Plus）是实时PCR实验的理想选择，其中特异性是关键。通过有效抑制底物二聚体和非靶标产物的扩增，可以实现并保持跨样品的高精度。这种试剂适用于已经优化了引物设计，但仍需要提高qPCR特异性的情况。
在这项研究中，转录因子E2F1的mRNA 水平在转染了实验或对照质粒的HEK293细胞中进行了分析。该协议使用TB Green Premix Ex Taq II（Cat。# RR820Q）在StepOnePlus实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行，使用30秒的延伸步骤。
熔解曲线分析表明对E2F1和GAPDH控制的特异性很高（图1，底部面板）。使用Delta delta Ct方法对原始数据进行相对量化。这个分析（图2）显示在E2F1没有显着差异。样本之间的mRNA水平，表明 TB Green 母液能够在低样本间变异的情况下提供可靠的结果。

 

图1。放大曲线（顶部）和熔解曲线（底部）为E2F1和GAPDH（内源性控制）。

 

图2。相对定量分析E2F1mRNA在转染了对照质粒和聚焦基因A质粒的HEK293细胞中的水平。
使用TB Green Premix Ex Taq II在实时PCR结果中获得了高特异性和低样本间变异性。这种预混剂在测试条件下提供了稳定的结果。

四、产品内容（Code No.: RR820A:50 μl 反应×200 次）

*1 内含 TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，TB Green。
*2 ROX Reference Dye是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例如使用 Applied Biosystems的Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。
◆ 需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)
◆ 需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器
Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)
◆ 不需要校正的仪器
Thermal Cycler Dice™ Real Time System series (Code No. TP950，etc.，TP700/TP900：终卖)
LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics)
CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)

五、保存 
4℃可保存 6 个月。
避光保存，避免污染。
长期保存请置于-20℃。产品融解后请于 4℃保存，并在 6 个月内用完。

六、注意事项
1．使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应不足。
a) 请勿涡旋振荡混匀。
b) TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X conc.)在-20℃存放可能会产生白色或淡
黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。
c) 沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。
2．配制反应液时，试剂请于冰上放置。
3．本制品中含有荧光染料 TB Green，配制 PCR 反应液时应避免强光照射。
4．反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。

七、操作方法（*请按照不同仪器的操作手册提供的方法操作）
（1）应用Thermal Cycler Dice Real Time System series 扩增仪的操作方法
1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。

▶通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。
▶在25μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
▶建议反应液体积为25μl。
2.进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
两步法PCR扩增标准程序：
Hold(预变性)
  Cycle:1
  95℃ 30秒
PCR反应
  Cycle:40
  95℃ 5秒
  60℃ 30秒
Dissociation

 

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
3.实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。
（2）应用Applied Biosystems7300/7500/7500Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10%。
 

▶通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。
▶ROX Reference Dye II（50X）比ROX Reference Dye（50X）浓度低，使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50X）。使用ABI 7300和StepOnePlus Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50X）。
▶在20 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
▶按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
2.进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。
< Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System >两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
  Reps：1
  95℃  30秒
Stage 2：PCR反应
  Reps：40
  95℃  5秒
  60℃  30～34秒*
Dissociation stage
* 使用StepOnePlus 时请设定在30秒。
使用7300时请设定在31秒。
使用7500时请设定在34秒。
< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1： 预变性
  Number of Cycles：1
  95℃ 30秒
Stage 2： PCR反应
  Number of Cycles：40
  95℃ 3秒
  60℃ 30秒
Melt Curve Stage

 

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
3.实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法请参考仪器的操作手册。

八、实验条件的选择 
如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和 PCR 反应条件的研讨。另外，根据反应情况选择特异性不同的Perfect Real Time系列试剂(Code No. RR420Q/A/B,RR430A/B,RR091A/B)，可提高PCR 反应性能。
实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应
体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。
▶反应特异性高的实验体系应具备以下条件：
No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。
不产生目的片段以外的扩增。
▶ 扩增效率高的实验体系应具备以下条件：
扩增产物起峰更早（Ct 值小）。
PCR 扩增效率高（接近理论值 100％）。
1. Primer 浓度与反应性能间的关系如下： 
降低 Primer 浓度有助于提高特异性；提高 Primer 浓度有助于提高扩增效率。图示如下：

 

2. PCR 条件与反应性能间的关系如下： 
① 要提高反应特异性，可以提高退火温度。

 

② 要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为 3 Step PCR 反应。

 

③ 预变性。
预变性条件通常设定为 95℃ 30 sec，使用此条件对于难变性的环状质粒 DNA 和基因组 DNA 模板
基本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件，可以延长至 1～2 分钟。但是时
间过长酶容易失活，不推荐使用 2 分钟以上的变性条件。
3. 各种试剂与反应性能间的关系如下： 
Takara Bio提供几种不同的TB Green嵌合法real-time PCR试剂，这些试剂的反应特异性以及扩增效率间
有以下关系。 TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR420Q/A/B）和TB Green Fast
qPCR Mix (Code No. RR430A/B)是扩增效率与反应特异性综合性较好、通用性高的试剂，但是，如果想
提高反应特异性，使用TB Green Premix DimerEraser™(Perfect Real Time)（Code No. RR091A/B）
和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)则更有效。