RIPA裂解液(强,无抑制剂)

Enhanced RIPA lysis buffer without inhibitors主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等组成，不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并维持原有的蛋白间相互作用。

多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，例如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(强)(Enhanced RIPA lysis buffer ,without inhibitors)是采用一种经典的细胞组织快速裂解，并获得总蛋白的裂解液，其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(中)。所获得的蛋白质可以用于Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。

操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
1、 取Enhanced RIPA lysis buffer室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。
2、 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、 按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于细胞1～3秒内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。
4、 10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、 取Enhanced RIPA Lysis Buffer室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。
2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl裂解液的比例，加入Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4、 10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、 取Enhanced Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加抑制剂。
2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越。取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
3、 按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15-30min。
4、 步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
5、 10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
6、 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
 
注意事项：
去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。
溶解RIPA Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免有效成分失效。
裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-KB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。