二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index P

特别提示：包括二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index Primer1-12)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index Primer1-12)
英文名称：NGS Multiplex Oligos for Illumina(Index Primers Set I)

产品货号：二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index Primer1-12)
产品规格：24次|96次

  本试剂盒提供了二代测序建库中使用的adaptor与primer，专为illumina平台建库设计，index primer的设计可满足多重高通量测序时制备多个文库样本的需要，制备的文库可用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。

试剂盒组成：

组份	24次	96次
Adaptor for Illumina	60μl	240μl
Universal Primer for Illumina	30μl	120μl
Index 1– 12 Primers for Illumina	12×10 μ l	12×20 μ l

自备仪器、试剂和耗材：
1、磁力架：建议使用DynaMagTM-2(货号： 12321D)。
2、DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(货号： WE0205)。
3、DNA建库试剂盒：建议使用百奥莱博二代测序快速DNA建库试剂盒(货号： WE0229)。
4、无水乙醇。
5、反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染。

实验前准备及重要注意事项：
1、Adaptor为双链结构，请勿将其置于室温温度以上，以免发生解链、影响使用。
2、Index primer开盖前请短暂离心，使液体收集到管底，以免不同引物间交叉污染。

使用流程


操作步骤：

百奥莱博二代测序多样本接头引物试剂盒使用方法请按照百奥莱博二代测序快速DNA建库试剂盒(Cat .No.WE0229)protocol进行。

Adaptor for Illumina：
5´-/5Phos/ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGT*C -3´
5´-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3´
Universal Primer for Illumina：
5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T -3´
Index 1–12 Primers for Illumina：

	Index Primers for Illumina	Index
Index 1 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATCACG
Index 2 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGATGT
Index 3 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TTAGGC
Index 4 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TGACCA
Index 5 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ACAGTG
Index 6 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GCCAAT
Index 7 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CAGATC
Index 8 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ACTTGA
Index 9 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GATCAG
Index 10 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAGCTT
Index 11 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GGCTAC
Index 12 Primerfor Illumina	5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGA CTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CTTGTA

储存条件：-20℃

除了二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index Primer1-12),，我公司还供应以下相关产品：



名称：ADAM12 mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0023
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.ADAM12 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲*50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
ADAM12的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。